基因定点诱变的常用方法是啥

‘壹’ 基因定点诱变是如何对蛋白质分子进行改造的

定点诱变不如叫定点突变，点突变的意思。在了解蛋白的编码序列基础上，改变特定的氨基酸残基可以使蛋白具有不同的性质。具体做法是对基因改造，对编码DNA做定点改造，可以用PCR方法，使用合成单链DNA引物引入突变；也可以用别的方法，比如M13之类的，很简单，从试验到验证几天就可以了。

‘贰’ 基因定向突变的技术的方法和原理

不论是真核生物还是原核生物的突变，也不论是什么类型的突变，都具有随机性、稀有性和可逆性等共同的特性。
①随机性。指基因突变的发生在时间上、在发生这一突变的个体上、在发生突变的基因上，都是随机的。在高等植物中所发现的无数突变都说明基因突变的随机性。在细菌中则情况远为复杂。
②稀有性。突变是极为稀有的，野生型基因以极低的突变率发生突变。
③可逆性。突变基因又可以通过突变而成为野生型基因，这一过程称为回复突变
。正向突变率总是高于回复突变率，一个突变基因内部只有一个位置上的结构改变
才能使它恢复原状。
④少利多害性。一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰或是死亡，但有极少数会使物种增强适应性。
⑤不定向性。例如控制黑毛a基因可能突变为控制白毛的a+或控制绿毛的a
说白了，随机性指的是突变的发生是随机的，何时何地何人是不一定的。
不定向性指的是突变的效果千奇百怪，如同本来是白色的可以变成红橙黄绿青蓝紫等等任何一种颜色都有可能。

‘叁’ 诱导基因突变的常用方法

诱导基因突变的常用方法：
一、碱基置换突变
可以通过两个途径即碱基结构类似物的参入和诱变剂或射线引起的化学变化来进行。
①类似物的参入5-溴尿嘧啶(BU）是胸腺嘧啶的结构类似物。它只是在第5位碳原子上以溴原子代替了胸腺嘧啶的甲基（─GH3），并且因此更易以烯醇式出现（图2）。基因突变
大肠杆菌在含有BU的培养基中培养后，细菌的 DNA中的一部分胸腺嘧啶被BU所取代，并且最后在培养物中可以发现有少数突变型细菌出现，取代BU的量愈大则突变型愈多。突变型细菌在不含有BU的培养基中长久培养时，不改变它的突变型性状，可是把突变型细菌在含有BU的培养基中培养后，又可以发现少数由于发生回复突变而出现的野生型细菌。BU的诱变作用可以表示。首先在DNA复制过程中酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T碱基对变为A:BU，在下一次DNA复制中烯醇式的BU*和鸟嘌呤G配对而出现G∶BU碱基对，最后在又一次复制中鸟嘌呤G和胞嘧啶C配对而终于出现G:C碱基对，完成了碱基的置换。这里BU所起的作用是促成这一置换，起促成作用的原因是由于嘧啶的 5位上溴原子代替了甲基后便较多地出现烯醇式的嘧啶。
同一理论还可以用来说明 BU是怎样诱发 的置换突变或者突变型的回复突变（图4)
2-氨基嘌呤等其他碱基结构类似物同样具有诱变作用。
②药物或射线引起的化学变化亚硝酸能够作用于腺嘌呤(A）的氨基而使它变为次黄嘌呤(HX）；可以作用于胞嘧啶（c）而使它变为尿嘧啶（U）。这两种氨基到酮基的变化带来碱基配对关系的改变，从而通过 DNA复制而造成A∶T→G∶C或者 G∶C→A∶T置换。
羟胺只和胞嘧啶发生专一性的反应，所以它几乎只诱发置换G∶C→A∶T而不诱发A∶T→G∶C置换。此外，pH值低或高温都可以促使DNA分子失去碱基特别是嘌呤，导致碱基置换。
紫外线的照射使 DNA分子上邻接的碱基形成二聚体，主要是胸腺嘧啶二聚体T-T。二聚体的形成使DNA双链呈现不正常的构型（见DNA损伤修复），从而带来致死效应或者导致基因突变，其中包括多种类型的碱基置换。

二、移码突变
诱发移码突变的诱变剂种类较少，主要是吖啶类染料（图6）。这些染料分子能够嵌入DNA分子中，从而使DNA复制发生差错而造成移码突变。

三、定向诱变
利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化，从而收到定向的诱变效果。例如将DNA分子用某一种限制性核酸内切酶处理，再用分解DNA单链的核酸酶S1处理，以去除两个粘性末端的单链部分，然后用噬菌体T4连接酶将两个平头末端连接起来，这样就可得到缺失了相应于这一限制性内切酶的识别位点的几个核苷酸的突变型。相反地，如果在四种脱氧核苷三磷酸(dNTP）存在的情况下加入 DNA多聚酶Ⅰ，那么进行互补合成的结果就得到多了相应几个核苷酸的两个平头末端。在T4接连酶的处理下，便可以在同一位置上得到几个核苷酸发生重复的突变型。
在指定的位置上也可以定向地诱发置换突变。诱变剂亚硫酸氢钠能够使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，但是这种作用只限于 DNA单链上的胞嘧啶而对于双链上的胞嘧啶则无效。用识别位点中包含一个胞嘧啶的限制性内切酶处理DNA分子，使粘性末端中的胞嘧啶得以暴露（例如HindⅢ的识别位点是，经限制酶HindⅢ处理后得到粘性末端，中间的这一胞嘧啶便暴露了）。经亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶（c）变为尿嘧啶（U)。通过DNA复制原来的碱基对C∶G便转变成为 T∶A。这样一个指定位置的碱基置换突变便被诱发。
还可以把人工合成的低聚核苷酸片段引入基因组中，以一定的方式改变某一基因等。

‘肆’ 基因定位诱变是啥呀

在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异性改变称为基因的定向诱变。利用这项技术一方面可对某些天然蛋白质进行定位改造，另一方面还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋白质结构及功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象及生物活性之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。一般而言，含有单一或少数几个突变位点的基因定向突变可选用下列五种策略，而大面积的定位突变则采取基因全合成的方法。

1 局部随机掺入法

将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒的特定位点上，其上游紧接着两个酶切位点RE1和RE2，它们分别能产生5’和3’突出的单链粘性末端。用大肠杆菌核酸外切酶III末端特异性降解经RE1和RE2双酶切开的重组质粒3’凹端，并通过酶解反应时间控制新生成的单链区域大小（单链区域越短，突变精度越高）。终止反应后，单链区域用Klenow酶补平，底物除四种正常的dNTP外，还包括一种特殊结构的脱氧核糖核苷酸类似物，在缺口填补过程中，该类似物掺入到DNA链的一处或多处。随后再用S1核酸酶处理单链末端，并以T4-DNA连接酶连接成环。重组分子转化大肠杆菌，在体内复制过程中，由于类似物的碱基配对非特异性，50%的扩增产物分子内部引入了错配碱基，并导致位点突变。由这种方法产生的突变体一般含有几对取代碱基，而突变的区域则取决于外切酶III末端降解的程度。

2 碱基定点转换法

能导致碱基定点转换的最简单方法是使用某些化学试剂在体外诱变DNA分子。通常将质粒DNA或待突变DNA片段用诱变剂处理后，转化大肠杆菌，构建突变体文库。最常见的体外诱变剂为亚硫酸氢钠，在DNA单链的情况下，它能特异性地使胞嘧啶残基脱氨形成尿嘧啶残基。处理后的DNA单链再由DNA聚合酶体外转化为双链结构，在复制过程中，原DNA分子上的CG碱基对便转换成TA碱基对。从表面上看这种方法所引入的突变并非定点，但如果合适地控制诱变剂的处理条件，便能做到每个DNA单链分子只含单一转换的碱基，而且其位点随机分布，这样即可在样本庞大的突变体文库中挑选出在期望位点上突变的重组分子。
除了上述化学诱变外，还可以借助于酶促合成对DNA分子进行所有可能的碱基对转换。其原理是使单链DNA在不理想的反应条件下进行体外复制，如较高或较低的离子强度、不平衡的四种核苷酸底物浓度以及缺少从3’至5’核酸外切活性的DNA聚合酶（Taq）等。在体外DNA聚合反应系统中，如果某种核苷酸底物浓度过低，当模板要求该底物时便有可能为其它三种底物所取代，从而导致序列突变。

3 部分片段合成法

如果在待突变的位点上下游含有合适的限制性内切酶识别序列，尤其当多个待突变位点集中分布在该区域时，可考虑直接化学合成这一片段，在此过程中将欲突变的碱基设计进去，然后以此人工合成的寡聚核苷酸片段置换重组质粒上对应的待突变区域，即可完成基因的定点突变。部分片段合成法特别适用于系统改变功能蛋白的氨基酸序列，并在体内观察突变位点对蛋白质生物功能的影响，从而确立突变前这些氨基酸残基对蛋白质结构和功能的贡献。例如，在大肠杆菌噬菌体433和P22阻遏蛋白分子中，-螺旋-转角--螺旋结构域与操作子DNA的结合特性就是用上述方法研究的。

4 引物定点引入法

引物定点引入法实质上是一种寡聚核苷酸介导的定点诱变方法，它能在克隆基因内直接产生各种点突变和区域突变。首先将待突变的目的基因克隆在M13-RF DNA载体上，转化大肠杆菌，挑选重组噬菌斑，从中分离出重组DNA正链；人工合成与待突变区域互补的寡聚核苷酸引物，并在此过程中设计引入突变碱基，然后在较温和条件下与重组DNA正链退火，经DNA体外复制和连接后，双链分子重新转化大肠杆菌；以上述合成的寡聚核苷酸片段为探针，在严格条件下（如将杂交温度提高5-10℃）杂交筛选含有突变碱基的噬菌斑，从中分离纯化出RF DNA双链分子进行克隆表达。相似地，若要在DNA特定位点上插入或缺失一段，也可设计合成特殊结构的寡聚核苷酸引物，并将之引入待突变区域。但须注意的是欲插入或缺失的DNA片段应小于引物本身的长度，否则退火操作相当困难。
从理论上来讲，在DNA体外复制并克隆后，携带突变碱基的噬菌斑应为重组噬菌斑总数的一半，但由于技术上的原因，这种期望的噬菌斑通常只有1～5%。为了特异性富集突变体便于筛选，可将待突变的重组M13-RF DNA分子首先转化具有t和ung两个DNA代谢酶基因缺陷的大肠杆菌受体菌株。前者由于不能合成dUTP水解酶，致使细菌细胞内dUTP含量急剧上升，在DNA体内复制时，dUTP部分取代dTTP掺入到DNA新生链中；后者为尿嘧啶糖基化酶基因缺陷，这种变异株丧失了切除DNA链中脱氧尿嘧啶核苷酸残基的能力。由该菌株产生的重组M13 DNA正链分子中大约有1%的T为U所取代，经体外复制后，再将双链DNA分子导入正常的大肠杆菌受体细胞中。此时，该菌的尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的脱氧尿嘧啶核苷酸残基，使原来的模板链降解，而突变链因不含U被完整地保留下来。

5 PCR扩增突变法

将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒上，重组分子分在含有两种不同引物的反应管A和B中。在A管内，引物I与克隆基因的区域互补，并含有唯一一个错配碱基（即突变位点），引物II则与载体区域完全互补，使得两个引物的末端位于待突变位点的右侧；在B管内，两个引物均与克隆基因互补，但引物III含有一个错配碱基，引物IV则完全互补，两个引物的末端位于待突变位点的左侧。经若干轮PCR扩增反应后，积累的双链DNA产物均为线型平头分子。将A、B两管的扩增产物混合变性并退火，只有I-III和II-IV杂合双链呈交叉缺口的环状结构且含有突变位点，这种分子不经连接可直接转化大肠杆菌，而其它组合形式的杂合双链则为线型分子，通常难以形成克隆。

‘伍’ 常用的基因突变检测方法有哪些

1、焦磷酸测序法

测序法的基本原理是双脱氧终止法，是进行基因突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。但其过程繁琐、耗时长，灵敏度不高，对环境和操作者有危害，故在临床应用中存在一定的限制。

焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。

焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力。为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

2、微数字聚合酶链反应

该方法为将样品作大倍数稀释和细分，直至每个细分试样中所含有的待测分子数不超过1个，再将每个细分试样同时在相同条件下聚合酶链反应后，通过基因芯片逐个计数。该方法为绝对定量的方法。

3、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。该法一般用于检测已知的突变位点。

因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中兇手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

4、高效液相色谱法

该方法是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异而进行检测的，可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。

与测序法相比，该法简单、快速，不仅可用于已知突变的检测，还可用于未知突变的扫描。但只能检查有无突变，不能检测出突变类型，结果判断容易出错。

5、单链构象异构多态分析技术

依据单链DNA在某一种非变性环境中具有其特定的第二构象，构象不同导致电泳的迁移率不同，从而将正常链与突变链分离出来。与测序法相比，灵敏性更高。

‘陆’ 跪求PCR方法定点诱变示意图，并附带说明（详细），谢谢！

Step1.单一基因经过易错PCR得到许多随机突变拷贝（图中为“DNA随机突变库”）

Step2.用限制酶将这些DNA切成许多随机片段（图中为“随机片段库”）

Step3.这些带有突变的片段【互为引物和模板】进行PCR扩增，那么这些突变会积累到子代DNA上。

注意：这一步会将突变传递给子代DNA，所以一部分子代DNA中会积累有许多有利突变，即对蛋白质性能的提高有利。

Step4.筛选出含有较多有利突变的子代DNA（图中表示为“正突变重组子”），去除含有较多不利突变的子代DNA。

Step5.重复上述步骤2~3次，则可以获得较好的结果。

‘柒’ 6，dna点突变常用的检测方法有哪些

基因突变检测方法：
（1）
pcr-sscp法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链dna和rna分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链dna在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
（2）异源双链分析法（ha）
ha法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型dna双链。由于突变和野生型dna形成的异源杂合双链dna在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双dna不同的迁移率。该法与sscp相似，所不同的是sscp分离的是单链dna，ha法分离的是双链dna，也只适合于小片段的分析。
（3）突变体富集pcr法（mutant-enriched
pcr）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如k-ras基因第12密码子的bstni位点，第13密古巴子有bgⅰⅱ位点。用链续二次的巢式pcr来扩增包括k-ras第12、13密码子的dna片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的dna片段，野生型因被酶切而不能进入第二次pcr扩增，而突变型则能完整进入第二次pcr扩增并得到产物的富集。