A. 简述主要免疫细胞分离方法和分离原理
免疫磁珠法分离细胞原理：
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：
阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞
一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。
BD™ Imag 磁珠：
· 大小在0.1－0.45mm
· 包被了BD Pharmingen生产的高质量单抗
· 磁珠已为白细胞亚群的阳性和阴性分离法所优化
· 用于BD™ IMagnet direct magnet
将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过BD™ IMagnet direct magnet分离得到的连有BD IMag磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。
缺点：
• 对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养
• 纯度低
• 容易阻塞FCM的喷嘴
BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分离系统的优点，开发出直径约200nm中等大小磁珠。
• 技术简单，分离在普通的试管中完成
• 易于增大细胞用量
• 对细胞温和，不影响细胞功能及其分离后培养，可直接上流式
• 纯度高，回收率高
• 成本低
此外，Mouse lineage panel中biotin标记的抗体还可用于FCM分析细胞表面抗原，以及进行细胞/组织免疫荧光实验。
BD提供2种免疫磁珠：
· 包被了针对白细胞亚群的单抗的磁珠
· 包被了链霉亲和素（streptavidin）的磁珠：此种情况下，在实验系统中加入生物素标记的单抗，磁珠通过streptavidin与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异性结合而使细胞被磁珠间接捕获，从而达到分离。这种磁珠使研究者可根据自己需要选择生物素标记的各种单抗去分离目的细胞，应用范围更广泛，使用更灵活。
不同物种磁珠分离试剂
人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；
小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.
ë 利用Streptavidin连接的磁珠，只需选配biotin标记的所需单抗,就能分离更多种类细胞
新货聚焦：
现在，BD PMG又推出用于分离小鼠造血干细胞/祖细胞的新试剂mouse lineage panel。
其中包括5种biotin标记单抗，这些单抗能结合小鼠造血细胞的主要分化系细胞: T、B淋巴细胞，单核/巨噬细胞，粒细胞和红细胞。将这组试剂与Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 联合使用，就能通过免疫磁性分离法去除小鼠骨髓造血细胞的主要分化系细胞，从而富集到造血干细胞和祖细胞（阴性片断）。
Mouse Lineage Panel（559971）：（5×2ml/vial） 可分离109 Mouse骨髓细胞
1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain)；
2) Biotin-anti-mouse CD11b；
3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220；
4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1)；
5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76)
磁分离细胞的重要指标是：
纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。
目前市场上有2种磁性细胞分离系统：
* Small particles (≈50 nm) － MACS
* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）
小磁珠 优点：
• 对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养
• 可直接上流式检测，不影响散射光
缺点：
• 需要很强的磁场来分离细胞
• 分离速度很慢，得率不高
• 需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行
• 成本昂贵
大磁珠
• 技术简单，分离可在试管中完成
• 易于增减细胞用量
• 速度快，得率高
• 成本低
B. 如何分离巨噬细胞与血细胞
你可以尝试差速离心，巨噬细胞密度应该大于血细胞吧。或者你用滤膜好了，巨噬细胞的体积更大
C. 如何从PBMC中将单核巨噬细胞提出
单核细胞 单核细胞描述：约占3％，体积大，胞质丰富，染成灰蓝色，胞核常呈肾形或马蹄形，细胞形状不一，有圆形，多角形等（因数量少，不易找到，可看示教片）
单核细胞是体积最大的白细胞。其细胞核常偏位，呈多形性，如卵圆形、肾形(a)、马蹄形(b)、不规则形（c）等，常有折叠感(c)；染色质呈疏松网状，着色较浅。胞质较多，嗜碱性，但因含大量细小的嗜天青颗粒而染成灰蓝色，颗粒含过氧化物酶。血涂片，Giemsa染色
无颗粒白细胞的一种。 单核细胞是血液中最大的血细胞。目前认为它是巨噬细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。单核细胞还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免性反应。单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统，还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。淋巴细胞则为具有特异性免疫功能的细胞。T淋巴细胞主要参与细胞免疫反应而B淋巴细胞参与体液免疫反应。
外周血单个核细胞 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
D. 检测巨噬细胞的功能还有什么方法
巨噬细胞功能检测方法：
人巨噬细胞可从外周血或经斑蝥激发的皮疱液中获取，也可从肺灌洗液或患者腹膜透析液中分离，但操作繁锁，得量不多。许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时，常选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，常用的检测方法如下。
（一）炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒医学教|育网搜集整理，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒，据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
（二）吞噬功能的检测
巨噬细胞具有较强的吞噬功能，实验室常用比细菌大的细胞性抗原作为被吞噬颗粒，如鸡红细胞。其检测原理是将受检细胞与适量的颗粒抗原混合后，置
37℃保温0.5～1h，其间时加振摇，最后离心取测定细胞制成涂片，染色镜检，分别计数出吞噬百分比和吞噬指数。各实验室应根据自己的条件建立正常参考值。
（三）巨噬细胞溶酶体酶的测定
巨噬细胞富含溶酶体酶，如酸性磷酸酶、非特异性酯酶、溶菌酶等，测定这些酶的活性也是衡量巨噬细胞功能的实用指标之一。
1.酸磷酸酶的测定
（1）硝酸铅法：本法优点是用普通试剂，价格便宜，一般实验室均有条件做，封片后可较长时间保存，并可用电子显微镜研究观察细胞的超微结构。缺点是细胞必需固定，而且固定条件要求严格，如处理不当酶活性易消失，反应步骤也较多。
该法基本原理是在适当的酶性条件下，巨噬细胞内的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸钠水解成磷酸盐后，后者与硝酸铅反应产生磷酸铅，而磷酸铅再与硫酸铵反应则形成黑色硫化铅，沉积在胞浆内酸所在处，显示棕黑色颗粒。酶活性强弱可根据颗粒的数量和粗细不同而分级判断，颗粒数量少则细的为+，颗粒多而粗的为++，颗粒很多且很粗的为+++.
（2）偶氮法：本法操作简便，反应液中的底物α-萘磷酸钠被酸性磷酸酶分解后，形成萘酚和磷酸盐，而萘酚结构中的羟基（-OH）邻近的活泼碳原子，立即与偶氮染料起反应，而产生鲜艳的棕色沉积在酶所在处，缺点是封片后保存时间短。
2.非特异性酶的测定该酶比较稳定，酶活性丧失较慢，细胞经涂片干燥，置室温至少可保存半天至一天，因此特别有利于临床检验室采用。
常用α-萘醋酸法，该酶可将-萘醋酸分解成萘酚和醋酸，萘酚迅速与偶染料结合，形成有色反应物而沉积。
（四）巨噬细胞促凝血活性测定
激活巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaC12混合液，加入经粘附单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。实验证明当巨噬细胞与LPS、肿瘤相关抗原或HbsAg等温育后，可见血浆凝固时间明显缩短。本法稳定方便，也是检测不同疾病患者巨噬细胞功能的指标之一。
E. 免疫细胞分类及分离方法是什么
免疫细胞（immune cell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术
1、淋巴细胞的分离
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min 水平离心20min，管内分为4 层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次，每次2000r／min 离心10min，最后用RPMI l640 培养液将细胞配成2×106／m1 的细胞悬液备用。
2、T 细胞及B 细胞的分离
将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。
3、CD4 细胞及CD8 细胞的分离
（1）CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4 细胞。
（2）CD8 细胞分离：用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿内，4℃放置2 小时，用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。
4、单核巨噬细胞的分离
单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02 温箱内温育1 小时，然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。
F. 请教：小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法
人巨噬细胞可从外周血或经斑蝥激发的皮疱液中获取，也可从肺灌洗液或患者腹膜透析液中分离，但操作繁锁，得量不多。许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时，常选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，常用的检测方法如下。单核细胞渗出血管，进入组织和器官后，可进一步分化发育成巨噬细胞，成为机体内吞噬能力最强的细胞。
巨噬细胞在不同组织中的名称不同：在肺里称“肺巨噬细胞”；在神经系统里称为“小神经胶质细胞”；在骨里则称为“破骨细胞”。
单核-巨噬细胞是对他们的统称。
G. 请教外周血单核，巨噬细胞的分离和培养方法
博凌科为以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等都是分化终末细胞.很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代,但是近来技术的发展,有血细胞培养纯化的 报道.血细胞可从外周血中用梯度离心法获得,也可从脾脏中用机械法切碎过筛分离获得(尤其是淋巴细胞).从腹腔冲洗可获得较多的巨噬细胞.也可从骨髓中取 前体血细胞,然后加上促进单核/巨噬细胞分化和生长的细胞因子,从而诱导前体血细胞向所要的细胞方向分化.
H. 如何分离小鼠肝脏kupffer细胞
Kupffer细胞是巨噬细胞中的一种。肝脏巨噬细胞(即Kupffer细胞)
肝巨噬细胞：又称库普弗细胞（Kupffer cells, KC），又称枯否细胞。位于肝血窦腔内，具有变形运动和活跃的吞噬功能，还具有处理和传递抗原、调节机体免疫应答等作用，属单核吞噬细胞系统主要成员。是清除细菌及其毒素从而拮抗感染的重要防御细胞，同时也通过释放各种炎症介质，在内毒素性肝损伤的发生中发挥主导作用 。
I. 求助鱼的巨噬细胞分离培养
求助鱼的巨噬细胞分离培养
吞噬细胞功能检测的临床应用 试验原理是将人巨噬细胞与鸡红细胞(chicken red blood cell，CRBC) 混合后孵育，通过计算巨噬细噬 CRBC 百分率和吞噬指数判断人巨噬细胞的 吞噬功能。通过观察 CRBC 消化程度，反映巨噬的消化功能。 一、中性粒细胞功能检测的临床意义 趋化能力显着下降见于 Chediak-Higashi 综合征、Lasy 白细胞综合征、 慢性皮肤黏膜白色念珠感染、糖尿病、烧伤等。正常新生儿中性粒细胞趋 化能力亦明显低下。吞噬能力明显低下者见于补或抗体缺陷症时。酶代谢 能力显着降低见于慢性肉芽肿、6 磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)高度缺陷。 NBT 试验不仅是检测中性粒细胞的胞内杀菌能力的试验，还作为疾病的 鉴别指标。正常人外血中性粒细胞 NBT 阳性率约为 10％，全身性细菌性感 染在 NBT 试验阳性率明显增高；病毒性感或无感染的低热患者阳性率一般 在 10％以下。器官移植病人术后因细菌感染伴发热时，NBT 阳性升高；而 因排斥反应发热者，NBT 则正常。故发热患者在暂无条件查清病因或检测报 告较迟时，可用 NBT 试验对发热病因作过筛性鉴别。 二、巨噬细胞功能检测的临床意义 单核巨噬细胞系统具有直接吞噬和杀伤病原体和肿瘤细胞的功能，还 具有参与抗原加工、递呈免疫调节的重要作用，检测巨噬细胞吞噬功能对 于判断巨噬细胞的功能，了解机体的特异性和非特性免疫状态有重要作用。 巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于原发和继发的吞噬细胞功能缺陷、 胃癌、肠癌等多种肿瘤病，肿瘤病灶中浸润的巨噬细胞与肿瘤的扩散与转 移呈负相关，检测这两个指标有助于判断机体抗肿的能力。
J. 如何获取机体中的吞噬细胞
一般从外周血中获得，具体方法如下：
1，外周血中单个核细胞（PBMC）的分离
肘静脉采血，加入抗凝剂，再以Hanks液稀释到3倍，密度梯度离心后，取中间的单个核细胞层，将此PBMC层移至另一离心管，以hanks液（或者生理盐水）清洗离心几次，其中的残留红细胞、血小板可以低渗裂解祛除。得到较纯净的PBMC，这其中就含有单核细胞（巨噬细胞）、淋巴细胞。
2，单核局势细胞的分离
巨噬细胞培养具有贴壁生长的特性，将上述PBMC至于细胞培养瓶中培养，淋巴细胞悬浮于培养液中，可以祛除，贴壁生长的就是单核巨噬细胞了。改变培养条件，就可以将其从贴壁上悬浮起来，稀释成适当浓度即可。
3，本方法仅提取的是外周血中的巨噬细胞，是常用的方法。
4，吞噬细胞是一类细胞的总称，在不同的组织中叫法不一样，所包含细胞也很多，血液中的吞噬细胞一般以巨噬细胞（单核细胞）为主