基因与细胞治疗方法

① 细胞治疗的原理是什么

您好

细胞治疗方法的原理是通过体外的基因改造，将CAR安装到T细胞上，进行体外扩增，最后回输到患者体内使其能够特异性识别并杀死癌细胞。经历了三代的发展。第一代CAR介导的T细胞激活是通过CD3ζ链或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3ζ链能够提供T细胞激活、裂解靶细胞、调节IL-2分泌以及体内发挥抗肿瘤活性所需的信号。但第一代CAR改造T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了限制，T细胞增殖减少最终导致T细胞的凋亡。第二代CAR在胞内增加了一个新的共刺激信号，常用的共刺激分子为CD28和CD137（4-1BB）。第三代CAR，增加了额外的共刺激信号，目前正在研究的第四代CAR-T则在为治疗的安全性考虑，增加了自杀基因等便于在T细胞完成抗癌作用后的体内消除，从而避免毒副作用。

CART细胞治疗还可以分为自体和通用的两种，患者的自体T细胞取出来进行改造，回输的治疗相对安全性较高，但由于很多癌症晚期的病患的自体T细胞已经非常虚弱，很难进行体外改造，体外扩增的数量往往非常有限，则考虑亲缘关系近的亲属或者通用性的CAR-T技术，即异源的T的免疫原性相关因素去除，在体外进行改造驯化，再回输给患者，这种通用性的CAR-T技术又被称为UCAR-T，国内外已经有很多新型的公司在做这方面的研究，结合最近CRISPR技术进行T细胞的体外改造，使其适用于大众患者，从而节约成本和治疗时间。

2017年，FDA(美国食品药品监管局)率先批准了全球第一、第二个CAR-T疗法上市，来自诺华公司的Kymriah和吉利德旗下Kite制药的Yescarta分别获批治疗特定类型的急性淋巴细胞瘤和大B细胞淋巴瘤，2017年被称为细胞免疫治疗的“元年”，2017年 12月11日，南京传奇生物科技有限公司（金斯瑞旗下的全资子公司）申报的LCAR-B38MCAR-T细胞自体回输制剂新药注册已被正式受理，2018年3月12日上午10点，国家药监局批准了LCAR-B38MCAR-T细胞自体回输制剂临床试验申请，这是我国首例获受理的CAR-T疗法。

② 基因治疗 方式

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。
基因治疗主要分为两类，一类为基因修正和基因置换，即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组，即基因打靶技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因失活，是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能;或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达。
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(一)基因矫正
纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。
(二)基因置换
指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。
(三)基因增补
把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去
(四)基因失活
将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。
(五)“自杀基因”
在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”。
(六)免疫基因治疗
免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。
(七)耐药基因治疗
耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1。
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(摘自：http://www.bio1000.com/reseach/biomedical/238005.html)

③ 基因治疗是指什么

基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。其中也包括转基因等方面的技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。 2017年10月19日，美国政府批准第二种基于改造患者自身免疫细胞的疗法（yescarta基因疗法）治疗特定淋巴癌患者。

遗传病的基因治疗(Gene Therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正缺陷基因而根治疾病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。基因是携带生物遗传 信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。

基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，如今开展的基因治疗只限于体细胞。生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，因此，如今更多地是采用体细胞基因治疗。体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以如今的观点看，骨髓胞是唯一满足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取，体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟；另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。因此，不仅一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等以骨髓细胞作为靶细胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也都以此作为靶细胞。除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。

(1)生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞中早期胚胎）使其发育成正常个体，显然，这是理想的方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。基因的这种转移一般只能用显微注射，然而效率不高，并且只适用排卵周期短而次数多的动物，这难适用于人类。而在人类实行基因转移到生殖细胞，并世代遗传，又涉及伦理学问题。因此，就人类而言，多不考虑生殖细胞的基因治疗途径。

(2)体细胞基因治疗：体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对特定座位基因转移，还有很大困难。

体细胞基因治疗采用将基因转移到基因组上非特定座位，即随机整合。只要该基因能有效地表达出其产物，便可达到治疗的目的。这不是修复基因结构异常而是补偿异常基因的功能缺陷，这种策略易于获得成功。基因治疗中作为受体细胞的体细胞，多采取离体的体细胞，先在体外接受导入的外源基因，在有效表达后，再输回到体内，这也就是间接基因治疗法。

体细胞基因治疗不必矫正所有的体细胞，因为每个体细胞都具有相同的染色体。有些基因只在一种类型的体细胞中表达，因此，治疗只需集中到这类细胞上。其次，某些疾病，只需少量基因产物即可改善症状，不需全部有关体细胞都充分表达。

概念
狭义概念
指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。

广义概念
指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。

④ 将外源基因导入原核细胞或真核细胞分别有哪些方法

1 物理方法
1.1 DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但注入量有限, 能够接触到的肿瘤细胞有限,故获得的肿瘤细胞转化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
1.2 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从而提高肿瘤细胞的转化率。
2 化学方法
即用化学方法构建非病毒载体系统，借之完成基因转导。主要包括以下两种。
2.1 脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一种有价值的体内基因转移方法。多用于体外转化细胞，或通过瘤组织内注射〔1〕进行体内转化,并已有少数临床应用的报告。目前常用的是阳离子脂质体(商品名为Lipofectin)。它可自发的与DNA形成复合物，保护外源DNA不被核酸酶降解，具有制备简单、安全无毒、无免疫原性、重复性、对基因片段大小无限制且转染操作方便等优点。由于它可与细胞膜直接融合而能有效地避免溶酶体破坏，故远比传统的脂质体效率高。缺点是靶向性有限。Nishikawa等〔2〕从BALB/c小鼠的尾静脉注射以荧光素酶基因为报告基因的质粒DNA-脂质体复合物， 发现肺、肝、脾等器官组织中都有荧光素酶基因及其产物，持续表达超过3个月。常规脂质体易被网状内皮系统(RES)细胞摄取，在巨噬细胞本身可成为靶细胞的部位，RES的这种亲合性是有利的。Hasegawa等〔3〕采用日本血凝病毒( hemagglutinating virus of Japan , HVJ)脂质体为载体，用HSV-tk/Gcv系统治疗肝癌发现，在体外试验中当Gcv的浓度100microg/ml时几乎所有肿瘤均被杀死，甚至当转导率只有20％时，也有1/3肿瘤被消灭。此方法重复应用效果更佳，且皮下注射未见明显的炎症反应。
2.2 受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。此法靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂，表达效率低下。利用氯哇抑制溶酶体酶或腺病毒与内吞小泡相融合而将其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
3 生物学方法
主要通过构建病毒载体来完成。
3.1 逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能〔4〕。
3.2 腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体〔5〕。体外制备滴度较大 ，装载外源基因容量最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起宿主免疫反应而使转染效率下降，且大剂量静脉给予可导致严重的肝脏炎症反应，因此通过全身给药受到限制。Nagao等〔6〕发现瘤内注射重组Adv后，目的基因可有效表达，但表达时间短暂，重复注射后表达效率降低且诱发体液和细胞免疫反应。
3.3 单纯疱疹病毒：单纯疱疹病毒(herps simplex virus，HSV)对非分裂细胞有天然的亲合力，装载外源基因容量达30kb，体外制备滴度接近腺病毒。但构建时难以除去与裂解细胞有关的基因而对细胞毒性大〔7〕。
3.4 腺相关病毒：腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)在人类不引起任何病理性后果，它能感染非分裂S相细胞，还能将基因转人非周期(noncyling)肿瘤细胞。AAV是一种缺陷前病毒，对人类无致病性。能用于运载外源性重组基因组，已应用于肝和肝癌细胞的治疗基因转移〔8〕。
3.5 其他病毒：痘苗病毒〔9〕(vaccini virus)可以独立在细胞之中复制和转录，并能以较强的方式表达多个肿瘤抗原。杆状病毒〔10〕(bacul virus)能够感染肝细胞和肝肿瘤细胞，并能增强肝细胞肿瘤坏死因子a(TNFa)、IL-1a、IL-lβ的表达。