国标食品毒理学试验方法有哪些

‘壹’ 食品毒理学的研究方法

毒理学的研究方法可分为两大类。一类是微观方法，另一类是宏观方法。根据采用方法的不同，可分为体内实验和体外实验 。
食品毒理学主要是借助于动物模型模拟引起人体中毒的各种条件，观察实验动物的毒性反应，再外推到人。
1.体内试验(in vivotest) ：也称为整体动物试验。可严格控制接触条件，测定多种类型的毒作用。实验多采用哺乳动物，例如大鼠、小鼠、脉鼠、家兔、仓鼠(hamster)、狗和猴等。在特殊需要情况下，也采用鱼类或其他水生生物、鸟类、昆虫等。检测外源化学物的一般毒性，多在整体动物进行，例如急性毒性试验，亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验等。哺乳动物体内试验是毒理学的基本研究方法，其结果原则上可外推到人；但体内试验影响因素较多，难以进行代谢和机制研究。
2.体外试验(in vitrotest)：利用游离器官、培养的细胞或细胞器进行毒理学研究，多用于外源化学物对机体急性毒作用的初步筛检、作用机制和代谢转化过程的深入观察研究。体外试验系统缺乏整体毒物动力学过程，并且难以研究外源化学物的慢性毒作用。 (1)游离器官：利用器官灌流技术将特定的液体通过血管流经某一离体的脏器(肝脏、肾脏、肺、脑等)，借此可使离体脏器在一定时间内保持生活状态，与受试化学物接触，观察在该脏器出现有害作用，以及受试化学物在该脏器中的代谢情况。(2)细胞：利用从动物或人的脏器新分离的细胞(原代细胞，primarycell)或经传代培养的细胞如细胞株(cellstrain)及细胞系(cellline)。(3)细胞器(organelle)：将细胞制作匀浆，进一步离心分离成为不同的细胞器或组分，例如线粒体、微粒体、核等，用于实验。
3.限定人体试验：通过中毒事故的处理或治疗，可以直接获得关于人体的毒理学资料，这是临床毒理学的主要研究内容。有时可设计一些不损害人体健康的受控的实验，但仅限于低浓度、短时间的接触，并且毒作用应有可逆性。保健食品的人体试食试验。
4.流行病学调查：通过流行病学调查的方法，不仅可以研究已知环境因素(外源化学物)对人群健康的影响(从因到果)，而且还可对已知疾病的环境病因进行探索(从果到因)。但流行病学研究干扰因素多，测定的毒效应还不够深入，有关的生物学标志还有待于发展。 如突发性大规模食物中毒的调查。
试验目的
急性毒性试验：测定LD50, 了解受试物的毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和毒性观察指标的选择提供依据，并根据LD50进行毒性分级；
遗传毒性试验：对受试物的遗传毒性以及是否具有潜在的致癌作用进行筛选；
致畸试验：了解受试物是否具有致畸作用
30天喂养试验：在急性毒性试验的基础上进一步了解其毒性作用，观察对生长发育的影响，并可初步估计最大未观察到有害作用剂量
亚慢性毒性试验--90天喂养试验：观察受试物以不同剂量水平经长期喂养后对动物的毒性作用性质和作用的靶器官，了解受试物对动物繁殖及对子代的发育毒性，观察对生长发育的影响，并初步确定最大NOAEL和致癌的可能性，为慢性毒性和致癌性试验的剂量选择提供依据；
代谢试验：了解受试物在体内的吸收、分布、代谢和排泄速度及蓄积性，寻找可能的靶器官；为选择慢性毒性试验的合适物种、品系提供依据，了解代谢产物的形成情况。
慢性毒性试验和致癌试验：了解经长期接触受试物后出现的毒性作用以及致癌作用；最后确定最大未观察到有害作用剂量，未受试物能否应用于食品的最终评价提供依据。

‘贰’ 食品安全性毒理学评价程序和试验方法有哪些标准

毒理学安全性评价是通过动物实验和对人群的观察，阐明食品中的某种物质（含食品固有物质、添加物质或污染物质）的毒性及潜在的危害，对该物质能否投入市场做出安全性的评估或提出人类安全接触的条件，以达到最大限度的减小其危害作用、保护人民身体健康的目的。
对人类食用这种物质的安全性做出评价的研究过程称为食品毒理学安全性评价。
应用食品毒理学的方法对食品进行安全性评价, 为我们正确认识和安全使用食品添加剂(包括营养强化剂)、开发食品新资源和新资源食品及保健食品的开发提供了可靠的技术保证，为我们正确评价和控制食品容器和包装材料、辐照食品、食品及食品工具与设备用洗涤消毒剂、农药残留及兽药残留的安全性提供了可靠的操作方法。
1.毒理学安全性评价的法律法规
①1994年8月10日批准通过中华人民共和国国家标准

现行GB15193.1-2003 《食品安全性毒理学评价程序》

②1991年12月颁发了《农药安全性毒理学评价程序》。

③1984年9月20日《中华人民共和国药品管理法》，

1988年卫生部颁布《新药(西药)毒理学研究指导原则》

④1987年5月28日国家标准《化妆品安全性评价程序和方法》

⑤1993年5月发布了《保健食品功能毒理学评价程序和检验方法(试行)》

⑥1987年国务院发布《化学危险品安全管理条例》
2.我国食品安全性毒理学评价法律法规和标准
食品安全性毒理学评价程序和试验方法（共21个标准）

GB 15193.1-2003 食品安全性毒理学评价程序

GB15193.2-2003 食品毒理学实验室操作规范

GB 15193.3-2003 急性毒性试验

GB15193.4-2003 鼠伤寒沙门氏菌
哺乳动物微粒体酶试验

GB15193.5-2003 骨髓细胞微核试验

GB15193.6-2003哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

GB15193.7-2003 小鼠精子畸形试验
GB 15193.8-2003 小鼠睾丸染色体畸变试验

GB 15193.9-2003 显性致死试验

GB 15193.10-2003 非程序性DNA合成实验

GB 15193.11-2003 果蝇伴性隐性致死试验

GB 15193.12-2003 体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验

GB 15193.13-2003 30天和90天喂养试验

GB 15193.14-2003致畸试验
GB 15193.15-2003 繁殖试验

GB 15193.16-2003 代谢试验

GB 15193.17-2003 慢性毒性和致癌试验

GB 15193.18-2003 日容许摄入量(ADI)的制定

GB 15193.19-2003 致突变物、致畸物和致癌物的处理方法

GB 15193.20-2003 TK基因突变试验

GB 15193.21-2003 受试物处理方法
为了保证毒理学实验结果的正确性，还必须规范整个毒理学实验条件和实验过程，其目的是规范试验方法和实验数据的收集和整理过程，确保实验数据的可靠性和可比性，以便管理部门据此做出正确决策。
为此，世界上一些国家和组织研究制定了毒理学良好实验室规范（Good laboratory practice，GLP），我国也在近年制定了GB15193.2-2003《食品毒理学实验室操作规范》。
根据我国卫生法规的规定：食品、食品添加剂、农药、兽药、工业化学品等各类可以经食物链进入人体的化学物质必须经过安全性评价，才能允许投产，进入市场或进行国际贸易。

‘叁’ 食品毒理学评价评价程序中规定,需进行四个阶段毒理学实验项目的化学毒物是什么

第一阶段：急性毒性试验：它是一次性投较大剂量后观察动物的变化，观察期大约为1周，从而判定动物的致死量（LD）和半致死量（LD50）。半致死量是指实验动物死亡一半的投药量。如果投药量大于5000mg/kg，无死亡，可认为该品毒性较低，无需做致死量精确测定。
第二阶段：遗传毒性试验，30 天喂养试验，传统致畸试验
遗传毒性试验的组合应该考虑原核细胞与真核细胞、体内试验与体外试验相结合的原则。从Ames 试验或V79/HGPRT 基因突变试验、骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、TK 基因突变试验或小鼠精子畸形分析（或睾丸染色体畸变分析试验）中分别各选一项。
①基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames 试验）为首选，其次考虑选用V79/HGPRT 基因突变试验，必要时可另选其它试验。
②骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验。
③TK 基因突变试验。
④ 小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析。
⑤ 其它备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验，非程序性DNA合成试验。
⑥30 天喂养试验。
⑦ 传统致畸试验。
第三阶段：亚慢性毒性实验：实验期在3个月左右，检验该品的毒性对机体的重要器官或生理功能的影响包括繁殖和致畸实验
第四阶段：慢性毒性实验：考查少量该品长期对机体的影响，确定最大无作用量（MNL），一般以寿命较短敏感的动物的一生为一个试验阶段，如用大白鼠试验2年小白鼠试验1.5年。
国际上常用ADI、LD50作为主要毒性安全性指标为，其中，ADI值（Acceptable Daily Intake）也就是每天每千克体重允许摄入的毫克数，联合国FAO/WHO所属的食品添加剂专家联合委员会（JECFA）每年依据各国所用食品添加剂的毒性报告提出，由联合国食品添加剂法规委员会（CCFA）每年年会讨论，并对某种食品添加剂的ADI做出评价、修改或撤销各国对此都已接受。大家知道，ADI值是根据对小动物（大鼠、小鼠等）近乎一生的长期毒性试验中所求得的最大无作用量（MNL）,取其1/100-1/500作为ADI值。各国依据ADI值制定出允许在食品中的最大添加量，就食品安全性方面来看，应该说是有保证的。

1） 几种常见的食品添加剂的ADI值见表1
表1
品名 ADImg/kg 最大使用量g/kg 用途
六偏磷酸钠 0-70 5.0 方便面
三聚磷酸钠 0-70 5.0 方便面
磷酸二氢钙 0-70 4.0 面包,馒头,饼干
磷酸氢钙 0-70 1.0 发酵制品,婴儿食品
过氧化苯甲酰 0-40 0.06 面粉熟化,增白
硬酯酰乳酸钙(CSL) 0-20 2.0 面包糕点
硬酯酰乳酸钠(SSL) 0-20 2.0 面包糕点
苯甲酸 0-5 0.2-1 食品防腐
山梨酸 0-25 0.2-2 食品防腐
乳酸亚铁 0-0.8 0.2-0.5 豆奶粉,豆粉
丁基羟基茴香醚(BHA)0-0.5 0.1-0.2 食用油脂,油炸食品,饼干,方便面,速煮米
二丁羟基甲苯(BHT) 0-0.3 0.2 早餐谷类食品

注：食品添加剂在食品中的最大使用量一般是依据JECFA推荐的"丹麦预算法(DBM)"来推算的,这种方法目前已被世界各国公认和采用,即:食品添加剂的最大使用量=40×ADI

2） 半数致死量(LD50)
LD50是判断食品添加剂安全性的第二种常用指标,也是任何食品添加剂都必须进行的毒理学评价中的第一个阶段急性毒性试验指标，它一般表明了食品添加剂急性毒性的大小。我国《食品安全性毒理学评价程序和方法》(GB 15193.3-2003)颁布的急性毒性（LD50）剂量分级标准表中将用于食品中化学物质依据LD50分成六大类,如表2
表2
毒性级别大鼠口服LD50mg/kg相当于人的致死剂量mg/kg相当于人的致死剂量g/人
极 毒 <1 稍尝 0.05
剧 毒 1—50 500—4000 0.5
中等毒 51—500 4000—30000 5
低 毒 501—5000 30000—250000 50
实际无毒 5001—15000 250000—500000 500
无 毒 >15000 >500000 2500

一般来讲,对动物毒性很低的物质,对人体的毒性也很低，LD50越大表明其毒性越小,在食品使用时其安全性越高,表3是几种常见的食品添加剂的LD50。
表3
品名 LD50 mg/kg GB2760规定最大使用量g/kg 主要用途
过氧化苯甲酰 7710 0.06 面粉处理剂
苯甲酸 2530 0.2-0.8 食品防腐剂
丁基羟基茴香醚(BHA) 2000-5000 0.2 抗氧化剂
二丁羟基甲苯(BHT) 890 0.2 抗氧化剂
亚硝酸钠 220 0.15残留0.05 肉制品着色剂
亚硝酸钾 200 0.15残留0.05 肉制品着色剂
通过表3可以看出,过氧化苯甲酰属于实际无毒类,苯甲酸属于低毒类,而肉制品常用的亚硝酸钠和亚硝酸钾以及早餐谷类所添加的营养强化剂氧化锌,都属于中毒类。