无菌检查试验的方法有哪些

1. 无菌检查法的抑细菌和抑真菌试验

在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作
用。用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭
菌、白色念珠菌均10～100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定
的温度，培养3～5天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。
如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不
生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和
法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。
检查法
无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品，后
者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。
操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌
的方法取内容物。
凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。
1. 直接接种法
(1) 供试品准备 供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶
液，按表1或表2规定量取供试品，混合。
供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料，
按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9%无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的
溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。
供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪
取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11
股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以
浸没供试品的适量培养基中。或用0.9%无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、
输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。
供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭
活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。亦可按薄膜过滤法检查。
供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。每
管接种量为0.2ml。
2.操作 取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌
培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培
养基5管。轻轻摇动,使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真
菌培养基管置20～25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照
管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外
观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上
继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用
接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。 2. 薄膜过滤法
如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下规定的方法处理
后, 加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中, 混合后，通过装有孔径
不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜
至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基
分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培
养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(
抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真
菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养
24～72小时有菌生长。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结
果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,
均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有
菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有
菌生长，否则应判为供试品不合格。

2. 什么是无菌检查法

无菌检查法
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)
酪胨（胰酶水解）
15g
氯化钠
2.5g
葡萄糖
5g
新鲜配制的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml)
硫乙醇酸钠
0.5g
琼酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
在无菌检查接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。
2.霉菌培养基
胨
5g
磷酸氢二钾（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸馏水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。
3.选择性培养基
(1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2) 吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装，115℃灭菌30分钟。
4.营养肉汤培养基
胨
10g
肉浸液
1000ml
氯化钠
5g
取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
5.营养琼脂培养基
照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5％葡萄糖肉汤培养基
胨
10g
葡萄糖
5g
氯化钠
5g
肉浸液
1000ml
取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，115℃灭菌30分钟。
7.霉菌琼脂培养基
照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。
培养基的质量应通过灵敏度检查。
培养基灵敏度检查法
1.菌种
(1)藤黄微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物,吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标 准管相同的浓度，然后，作10倍系列稀释并计数。

将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。
3.结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种菌量均应小于10个），三次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判定标准。
需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。
[附注]
肉浸液制备法
取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后,每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
对照用菌液
1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内,在30～35℃培养16～18小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。
检查法
1. 直接接种法
(1) 供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 任取供试品2支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照, 另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量,按下列规定取用：
供试品装量
每管接种量
培养基分装量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接种后轻轻摇动,使匀。需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日, 霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时,可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
(2) 供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
(3) 供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
(4) 供试品如为外科敷料，取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装,于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
(5) 供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
(6) 供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下,取最大规格量2份，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。
(7) 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
2. 薄膜过滤法
(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下取最大规格量2份, 分别按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9％灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中, 摇匀, 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后,用0.9％灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜,分成4片, 取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中, 其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照, 另1片放在霉菌培养基管中。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

(2) 供试品如为抗厌氧菌药品，取规定量的供试品，按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中，1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。另1片放在霉菌培养基管中。 取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(3) 供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜,分成4片，取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中,其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时,可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。