流感病毒分离培养的方法有哪些

❶ 流行病毒的分离培养与鉴定实验的原理

RT-PCR。利用Vero细胞进行雹庆病原分离，经RT-PCR鉴定颂简及测序分析。血液、体液、分泌物、粪便等宿主来源并包含野肆裤病毒的物质称病料，病毒分离时，传代细胞系、原代细胞是常用的分离方法。

❷ 怎样培养流感病毒

1 用于培养流感病毒的细胞1󰀁1 细胞株的选择 在最初培养流感病毒的时候用鸡胚,但鸡胚分离流感病毒容易引起病毒便变异和过敏性反应,还存在大规模生产时外源病毒的污染问题。而运用Vero和MDCK细胞培养流感病毒不但解决了上述问题,还使得病毒的免疫原更稳定。戚凤春[1]等人研究发现,相同的实验条件下,在MDCK细胞上培养的病毒HA滴度明显高于Vero细胞,因此我们培养流感病毒细胞株的选择MDCK细胞,其代数最好小于35代,细胞过老会使病毒不容易负载。 1󰀁2 细胞最佳负载病毒的胞龄 MDCK细胞繁殖非常旺盛,必需只能提前一天将细胞培养瓶里的细胞接种在六孔板中,如果负载病毒用胞龄为两天的MDCK细胞,那么病毒培养的阳性率几乎为0,而胞龄为12-24h的MDCK细胞对病毒的负载阳性率禅闷区别不大[2]。1󰀁3 细胞负载病毒的最佳密度 首先,MDCK细胞的密度不能太稀,这种细胞密度太稀则不能生长,也不能让细胞密得堆积起来,那样也会很大程度降 低病毒接种的阳性率。最好使细胞刚刚铺满孔,这时负载病毒后收获病毒的HA滴度最高。当工作人员提前一天将细胞接种在6孔板中时,应考虑细胞的生长速度,使其第二天负载病毒时的细胞密度适当。其次,MDCK细胞接种六孔板时要密度均匀,容易出现的情况是细胞都聚集在孔的边缘,而中间密度过稀,这样也会影响病毒负载的阳性率。避免这种情况出现就要工作人员手法熟练,如果出现了这种情况,将培养板轻轻晃动(避免液体溅出),能有效改善细胞的分布。2 培养流感病毒的试剂 用于培养流感病毒试剂的不同也会很大程度影响病毒培养 阳性率。首先,不使用过期的试剂;其次,最好使用知名厂家的试剂,比如GIBCO等;再次,使用前将试剂从冰箱拿出一段时间,最好等试剂的温度已经平衡到室温再用。如果是给细胞换代,过冷的试剂会影响细胞的生长状态;如果是负载病毒前洗细胞用,过冷的试剂会使细胞突然皱缩而病毒培养的阳性率。3 样品 3󰀁1 样品的存放 样品存放的时间直接影响病毒负载的阳性率,标本越新鲜,病毒培养的阳性率越高。如果样品不能及时负载细胞,应将样品放在-70!冰箱中,避免反复冻融,冻融次数越多,病毒培养的阳性率越低。注意不能将样品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不稳定,如果当天的样本要第二天才能接种,应将样品放在4!冰箱中。3󰀁2 样品的无菌处理 因为样品的采样条件不可能无菌,虽然采样液中有抗生素,也不能保证细菌全被杀死,所以阳性样本最好过滤到无菌的1󰀁5ml离心管中备用。有些工作人员采用往细胞培养板中加抗生素避免污染,这样虽然省事,但会对细胞有伤害,从而降低了病毒培养的阳性率。4 病毒负载的操作步骤4󰀁1 细胞洗涤 将六孔板中的细贺纯弯胞培养液倒去,用HBSS洗涤每一孔三遍以上,其作用是洗去残留的FBS,FBS通过抑制胰酶而抑制流感病毒的复制。将洗液倒去后,应立即加入洗液或病毒液,过长时间将细胞暴露在空气中将很大程度降低病毒培养的阳性率,最好将细胞暴露在空气中的时间缩短在5秒以内。4󰀁2 病毒液的接种量 病毒液的接种很有讲究。负载在细胞上的病毒液应大于300u,l否则不够盖过整孔细胞。待37!孵育1~2h后,不管开始负载了多少体积的病毒液,都应在每孔留300ul病毒液再加入病毒培养基,若病毒液全都弃去或留得太少,会使病毒培养阳性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超过400u,l也会使阳性率降低很多,因为存留过多的缺损病毒会严重影响正常病毒的复制。4󰀁3 病毒液的孵育时间 理论上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我们发现1h还是太短,最好在1h15min加入病毒培养基,不要时间过长,那样也会使病毒培养的阳性率降低,可能是因为采样液的pH值和病毒培养基不同,孵育时间稍长导致细胞受到损伤。而盲传的时候,孵育的时间可以到2h以上,因为这时候所用的病毒液也是病毒培养基,而不是采样液。4󰀁4 病毒培养基的配制 病毒培养基是用DMEM加入HEPES和胰酶配制而成的,HEPES的作用是加强体系的缓冲能力,胰酶的作用是将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解型的HA1+HA2,从而提高流感病毒在细胞中的复制能力,因为流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。但是裤缓HEPES和胰酶在DMEM在4!共存时间过长会引起pH值上升,所以病毒培养基我们一般都是现配现用。 4󰀁5 病毒HA滴度的测定 CPE出现时间随病毒的型别和毒株的差异以及感染量的大 小而异。我们将标本接种后3d观察是否出现CPE,出现CPE的测定HA滴度,滴度大于8则收获病毒,用HI实验测定病毒亚型,病毒滴度小于8进行盲传,再在第3d测定HA滴度。若负载病毒7d还不出现CPE,维持液中又查不出HA活性,可认为阴性标本,弃之。3d时间出现病毒滴度的 最高峰, 4d和2d都低于3d时病毒的滴度。收获毒株前,将 细胞于-80!/37!冻融一次,有利于增加病毒的HA滴度。

❸ 培养流感病毒的方法有哪几种

鸡胚传代培养、MDCK细胞培养、本动物回归培养。

❹ 目前病毒分离培养最常用的方法是

一般来说病毒培养的方法有三种 一是动物接种 常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。二是鸡胚接种 鸡胚对多种病毒敏感。根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜。第三是组织培养 将离体活组织块或分散的活细胞加以培养，统称为组织培养。组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。 最常用的应该是细胞培养。

❺ 流行性感冒的诊断

根据病因、临床表现及实验室检查即可做出诊断。病原学相关检查：主要包括病毒分离、病毒抗原、核酸和抗体检测。病毒分离为实验室检测的“金标准”；病毒的抗原和核酸检测可以用于早期诊断；抗体检测可以用于回顾性调查，但对病例的早期诊断意义不大。1.病毒核酸检测以RT-PCR（最好采用real-timeRT-PCR）法检测呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰）中的流感病毒核酸。病毒核酸检测的特异性和敏感性最好，且能快速区分病毒类型和亚型，一般能在4-6小时内获得结果。2.病毒分离培养从呼吸道标本中分离出流感病毒。在流感流行季节，流感样病例快速抗原诊断和免疫荧光法检测阴性的患者建议也作病毒分离。3.病毒抗原检测（快速诊断试剂检测）快速抗原检测方法可采用免疫荧光的方法，检测呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物中的黏膜上皮细胞），使用单克隆抗体来区分甲、乙型流感，一般可在数小时以内获得结果。其他还有胶体金试验，一般能在10～30分钟获得结果。对快速检测结果的解释应结合患者的流行病史和临床症状综合考虑：在非流行期，阳性筛查结果有可能是假阳性；在流行期，阴性的筛选检测结果可能是假阴性；这两种情况均应考虑使用RT-PCR或病毒分离培养作进一步确认。4.血清学诊断检测流感病毒特异性IgM和IgG抗体水平。动态检测的IgG抗体水平恢复期比急性期有4倍或以上升高有回顾性诊断意义。

❻ 病毒的分离培养的原理

原理通过组织培养法分离培养HSV。
通过每天观察病毒对敏感细胞的细胞病变作用，初步确定病毒的存庆汪在。CPE通常是HSV感染的特征性改变，但其他疱疹病毒如水痘带状疱疹病毒（VZV）、巨细胞病毒（CMV）感染也可引起类似的CPE，因而需要通过免疫学方法。
病毒必须在易感的活细胞内才能增殖，因此，根据不同病毒选择敏感动物，离体组织细胞和鸡胚进行分离培养。实验方法原理鸡胚培养方法操作简便，适用于余差滑流感竖腊病毒，痘病毒，疱疹病毒和脑炎病毒等的培养。最常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜接种法，羊膜腔（羊水囊）接种法，尿囊腔接种法和卵黄囊接种法。