质粒dna的转化的方法有哪些

Ⅰ 细菌基因转移与重组的方式有哪些

细菌基因的转移与重组的方式有转化、转导、溶原性转换、接合。

1、转化：受体菌直接摄取供体菌游离的DNA段，从而获得新的遗传性状。

2、转导：以温和噬菌体为载体，将供体菌的遗传物质转移到受体菌中去，使受体菌获得新的遗传性状。

3、接合：是指细菌通过性菌毛将遗传物质（主要为质粒）从供体菌转移给受体菌，使受体菌获得新的遗传性状。

4、溶原性转换：是由于温和噬菌体的DNA（前噬菌体）整合到宿主菌的染色体DNA后，使细菌的基因型发生改变，从而获得新的遗传性状。

(1)质粒dna的转化的方法有哪些扩展阅读：

细菌基因的转移与重组属于细菌变异。细菌从外源取得DNA，并与自身染色体DNA进行重组，引起细菌原有基因组的改变，导致细菌遗传性状的改变。

细菌变异现象在临床上的实际意义:

1、诊断：应注意细菌的变异株，以免误诊，漏诊。

2、治疗：为提高抗菌药物疗效，防止耐药菌株的出现与扩散，在治疗前应先做药敏实验。

3、预防：用人工方法使病原出产生变异，减低毒力，保存免疫原性，制备减霉活疫苗，预防传染病。

Ⅱ 质粒转化步骤

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原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。

感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

质粒的转化主要包含

Ⅰ感受态细胞制备

Ⅱ质粒DNA转化

Ⅲ质粒DNA的提取

（Ⅰ）感受态细胞制备

1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。

3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min（4000r/min）。

4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）

6）4℃离心10min（4000r/min）。

7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。

8）可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。

（Ⅱ）质粒DNA的转化

1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。

冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。

2）冰浴30min，离心管放到42℃保温90s（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。

3）向离心管加800ulLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。

4）取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16h，出现菌落。

5）菌落结果：

① 无菌落

失败或者培养条件不充分

② 布满菌落,

呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致

③ 布满菌落

浓度太高，失败

④ 出现菌落

符合要求

Ⅲ）质粒DNA的提取

质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解，能够避免实验过程中的一些问题，或者能够更好的解决问题。

各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同，一般的提取纯化试剂盒，主要包括以下试剂：

A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA，金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖，可用来增加溶液粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉淀时间。

B. 细胞裂解试剂：主要作用是裂解细胞，通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构，使其双层膜结构改变，而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是，碱溶液的作用时间不能太长，也不可剧烈离心管，反之会导致碱破坏基因组DNA，导致同等大小的基因组DNA被提纯，造成污染。

C. 中和试剂：主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质，并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸，或者乙酸钾和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响，因此在后续洗脱DNA前，必须完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通过重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.细胞收获：对于高拷贝质粒（培养液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培养液,离心去上清；对于低拷贝质粒（培养液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培养液，离心去上清。

3. 细胞悬浮：加0.4mL的细胞悬浮液(containing RNase A)悬浮细胞，并使其混匀。

4. 细胞裂解：加入0.4mL细胞裂解液，通过上下颠倒带盖子管子5次使其轻轻混匀，不要涡旋，之后在室温下放置5min.

5. 中和：加入0.4mL的中和试剂，立即混合均匀。当大的细胞颗粒被处理后，可能会进行更剧烈的摇动。但是，不要涡旋！~12,000xg离心混合物10min. 如果是采用的4°离心，上清液需要恢复到室温，再加入到柱子中。

6. 装柱：吸取步骤5中的上清液到平衡柱中。让混合液通过重力的作用流出，弃掉流出液。

7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脱柱子量次。每次清洗让清洗液通过重力的作用流出，弃掉流出液

8. 质粒DNA洗脱：加入0.9mL的Elution Buffer。让Elution Buffer通过重力的作用流出。不要强行弄出里面的液体。

9. 质粒DNA沉淀：加入0.63mL异丙醇去析出，混匀，~12,000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清，之后风干10分钟

10. DNA纯化：将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。

重组质粒鉴定的方法：

① 双酶切后跑电泳；直接DNA电泳可判断整个DNA重组质粒是否正确。② PCR(插入片段在2kb以下时)，然后电泳。

③ 送公司测序（最为准确的鉴定方式）。

影响转化效率的因素：

① 细胞状态和细胞密度: 培养菌最好选用传代次数少，且保存于-70℃或者-20℃。不要使用经过多次转接或者保存于4℃环境中培养菌。细胞生长密度以刚进入对数其为最好，可通过检测培养液的OD600值来判断，密度过高或者不足，都会影响转化效率。通常DH5α菌株在OD600的值为0.5左右，细胞密度在5*107个/ml左右比较合适。密度过高或者不足均会影响转化效率。

② 质粒的质量和浓度：转化的质粒DNA中，超螺旋状态的质粒，转化效率最好。在一定浓度范围内，转化的效率与添加质粒的浓度成正比。不过在添加的质粒的量和体积过大的时候，转化效率也会降低。质粒的分子量越大，通常来说转化率也会降低。

③试剂的质量：转化过程中所用的试剂，如氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率。

④防止杂菌和DNA污染：实验需要在无菌条件下进行，所用的仪器和试剂均需要灭菌处理，并防止在实验过程中引入其他污染。

⑤培养过程的条件：培养瓶中培养基的量关乎到菌体生长过程中的能量代谢。通常来说厌氧环境做出来的感受态的转化效率较低。建议500ml三角瓶液体培养基量不超过100ml, 250ml三角瓶液体培养基量不超过50ml. 培养基的pH值要适宜，接种前一般pH值在6.8-7.2，等培养结束后可以再测一下pH值最好在6.5以上（不低于6.0），表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。培养基中的各种离子和温度，也对形成好的感受态有关系。

几种扩增常用感受态细胞：

① 普通骨架载体cDNA产品

DH5α：常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选

TOP10：适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能够保证高拷贝质粒的稳定遗传。

TG1: 生长速度快，常用于噬菌体的制备，同时也可用于普通质粒的构建。

CopyCutter：适用于有毒克隆。

② 慢病毒载体质粒：

Stbl3: 是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率

Stable（NEB）：可用于逆转录病毒/慢病毒载体系统扩增。

Ⅲ 质粒的转换的方法有哪些质粒转化后如何筛选

转化的方法：最常用的是感受态法，包括热激和电转化等，转染不是转化，这是不同的概念。

转化后，可以根据质粒上带有的某种特殊基因的表达来鉴定菌落，最常用的有：抗药性基因的表达，比如质粒带有氨苄抗性基因，能在AMP平板上长的一般可以初步判断为转化成功的菌；还有就是显色筛选，比如质粒上的LacZ基因表达，间接促使添加了X-gal的培养基变蓝，绿色荧光蛋白基因表达后菌落发荧光等。

Ⅳ dna转化有哪些方式合有何优点

DNA转化的范围较广，但以植物细胞中的转化为主，现将其方式及优点阐述如下：

1、农杆菌介导基因转化：

• 转化原理:农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

• 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。

2、基因枪转化：

• 转化原理：利用火药爆炸或高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。

• 特点：基因枪转化率差异很大，相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高，嵌合体比率大，遗传稳定性差。它的一个主要优点是不受受体植物范围的限制，而且其载体质粒的构建也相对简单。

3、花粉管通道法：

• 转化原理：在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

• 特点：不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

Ⅳ 什么是DNA直接转化法

通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。如果外源DNA分子是病毒（噬菌体）的DNA或cDNA，那么把此过程也称为转染。（1）直接转化法：有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源DNA，只要外源DNA与这样的细胞混合，在适宜的条件下悬浮培养，就能完成外源DNA的转化。

（2）化合物诱导转化法：用二价阳离子（如Mgsuperscript2+superscript、Casuperscript2+superscript、Mnsuperscript2+superscript）处理某些受体细胞，可以使其成为感受态细胞，即处于能摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。采用这种转化方法，1μg质粒DNA可以获得5×10superscript6superscript7×10superscript7superscript个被转化的菌落（转化子），这是实验室中常用于微生物的一种转化方法。

（3）接合转化法：接合转化是通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。该转化系统一般需要三种不同类型的质粒，即接合质粒、辅助质粒和运载质粒（载体）。这三种质粒共存于同一宿主细胞，与受体细胞混合，通过宿主细胞与受体细胞的直接接触，使运载质粒进入受体细胞，并在其中能稳定维持。现在常把接合质粒和辅助质粒同处于一宿主细胞（辅助细胞），再与单独含有运载质粒的宿主细胞（供体细胞）和被转化的受体细胞混合，使运载质粒进入受体细胞，并在其中能稳定维持。也有把接合质粒和运载质粒同处于一宿主细胞，再与单独含有辅助质粒的宿主细胞和被转化的受体细胞混合进行转化的。由于整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，因此称为三亲本接合转化法，此方法主要用于微生物细胞的基因转化。

（4）激光微束穿孔转化法：此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束（laser：microbeam）聚焦成微米级的微束照射受体细胞，利用其热损伤效应可导致细胞膜的可逆性穿孔。根据这一原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源进行照射，导致细胞膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。这种方法操作简便快捷，基因转移效率高，无宿主限制，可适用于各种植物细胞、组织、器官的转化操作，并且由于激光微束直径小于细胞器，可对线粒体和叶绿体等细胞器进行基因操作，但该方法因仪器昂贵，转化率较低，故有待于进一步研究和完善。

（5）超声波处理转化法：由于超声波频率高、波长短，因而在传播过程中具有定向性好、能量大、穿透力强等特征。超声波法转化（ultrasonic：transformation）法就是利用低声强脉冲超声波的生物学效应击穿细胞膜造成通道，从而使外源DNA进入细胞。此转化途径可以避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活。超声波处理转化法的转化率较高，并且利用超声波处理可以避免使用电穿孔转化时高电压脉冲对细胞的损伤，有利于细胞存活，目前主要用于微生物细胞的基因转化。此外，该法具有操作简便、设备便宜、不受宿主范围限制等优点。

（6）脂质体介导转化法：脂质体（liposome）法是根据生物膜的结构和功能特征，用磷脂等脂类化学物质合成的双层膜囊将DNA或RNA包裹成球状，导入原生质体或细胞，以实现遗传转化的目的。脂质体法有两种具体方法：其一是脂质体融合法（liposome：fusion），先将脂质体与原生质体共培养，使脂质体与原生质体膜融合，而后通过原生质体的吞噬作用把脂质体内的外源DNA或RNA分子高效地转入到植物的原生质体内，最后通过原生质体培养技术，再生出新的植株；其二是脂质体注射法（liposome：injection），通过显微注射把含有外源遗传完整的脂质体注射到植物细胞以获得转化。

（7）电击法：电击法（eletroporation）也称电穿孔法，其原理是利用高压电脉冲作用在原生质体上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源目的基因的摄入。随着技术的改进，并与化学法结合，目前该法的转化率可高达1.2%。

（8）磷酸钙转染法：磷酸钙转染法的依据是有的动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA—磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。基本操作过程为：将待转染的外源DNA同CaClsubscript2subscript混合制成CaClsubscript2subscript·DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers—磷酸钙溶液中，形成DNA—磷酸钙共沉淀复合物，然后用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞的表面上，保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养基继续培养，直至外源基因表达。