疾病鉴定有哪些方法

❶ 花卉病毒类似病害的诊断和鉴定方法有哪些

植原体、螺原体等无壁菌门的原核生物造成的植物病害与植物病毒产生的症状相似，无病症表现，因此，它们又叫病毒类似病害。花卉上比较常见的是植原体病害，因此我们介绍一下植原体病害的诊断和鉴定。

1 超薄切片，电镜下观察植原体

方法如植物病毒的超薄切片和电镜观察。

2 抗生素治疗诊断

用四环素、土霉素和金霉素等对受病植株进行叶面喷施和灌根，植原体对这几种抗生素敏感，病害症状可以得到缓解。而植物病毒对抗生素不敏感，如果施用，对病害无效。

3 植原体PCR检测

根据植原体的共同保守序列，用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到植原体的特异扩增带。

还可以将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到与引物设计相符的植原体的特异扩增带，说明为植原体病害。

这里以仙人掌植原体丛枝病的PCR检测为例，介绍植原体的PCR检测技术。

实验操作如下：

Ⅰ.总核酸提取

（1）取0.3g植株幼嫩组织，用液氮冷冻后充分研磨成粉状。

（2）移入含有0.6ml预热到60℃的CTAB DNA提取缓冲液中，在60℃水浴中温浴30min。

（3）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），抽提30min。

（4）12000r/min离心8min，取上清液，重复（3）、（4）步直至蛋白质除尽。

（5）加入氯仿∶异戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min离心8min，取上清液。

（6）加入等体积预冷的异丙醇及1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.2），混匀，-20℃保持至少30min，14000r/min离心10min，使核酸沉淀。

（7）用70%乙醇洗涤2次后，.真空干燥。

（8）沉淀溶解于100μl TE缓冲液中。

（9）取10μl DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，计算DNA浓度。其余于-20℃冰箱中保存备用。

Ⅱ.PCR扩增

参照Lee所报道的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′

R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′

R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′

引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μmol/L。

直接PCR（Direct-PCR）：

（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列试剂

10×PCR反应缓冲液 5μl

5mmol/L MgCl2 4μl

2.5mmol/L dNTP 4μl

R16mF2（或R16F2） 3μl

R16mRl（或R16R2） 3μl

4U/μl 1TaqDNA聚合酶 1μl

模板 2μl

加入双蒸水至终体积为50μl，混匀并加入30μl石蜡油。

（2）PCR扩增。反应循环为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存。

（3）取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

巢式PCR（Nested-PCR）：

将用引物对R16mF2/R16mRl扩增的直接PCR产物按1∶40比例稀释后，作为反应模板，引物对换为R16F2/R16R2，退火温度升高至60℃，其余反应条件同直接PCR。

Ⅲ.结果

用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到一条约1.5kb的特异扩增带（图1）。通过实验，用泡桐丛枝作为植原体的阳性对照，检测出YNOl样品（仙人掌品种珊瑚枝丛枝）和YNO2（仙人掌品种堆罗汉丛枝）为植原体病害。其他YNO3（仙人掌品种猪耳掌丛枝）、YNO4（仙人掌品种金狮子丛枝病）、YNO5（仙人掌品种青海波丛枝）不是植原体病害，可能为品种的特性。

图1 直接PCR扩增结果

❷ 病毒鉴定常用方法有哪些

寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。
开展蚊媒寨卡病毒检测时，对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测。
开展寨卡病毒实验室检测时，应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。
（一）临床标本检测。
1．病原学检测
病原学检测主要适用于急性期血液标本，一般认为发病7天内检测阳性率高。
（1）核酸检测：采用荧光定量RT-PCR方法，是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。
（2）病毒分离：将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。
2．血清学检测
（1）血清特异性IgM抗体：发病3天后可检出病毒特异性IgM抗体，但发病7天后检出率高。可采用ELISA、免疫荧光等方法检测。IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗体与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等黄病毒有较强的交叉反应，易于产生假阳性。
（2）中和抗体：采用空斑减少中和试验方法检测。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙脑等其他常见黄病毒感染，可以确诊。
（二）媒介标本检测。
1．标本处理
将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点，每10～20只为一份进行研磨处理。
2．病毒核酸检测
用RT-PCR的方法进行寨卡病毒核酸检测
3．病毒分离
病毒核酸阳性的标本进行病毒分离。