寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。
开展蚊媒寨卡病毒检测时，对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测。
开展寨卡病毒实验室检测时，应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。
（一）临床标本检测。
1．病原学检测
病原学检测主要适用于急性期血液标本，一般认为发病7天内检测阳性率高。
（1）核酸检测：采用荧光定量RT-PCR方法，是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。
（2）病毒分离：将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。
2．血清学检测
（1）血清特异性IgM抗体：发病3天后可检出病毒特异性IgM抗体，但发病7天后检出率高。可采用ELISA、免疫荧光等方法检测。IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗体与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等黄病毒有较强的交叉反应，易于产生假阳性。
（2）中和抗体：采用空斑减少中和试验方法检测。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙脑等其他常见黄病毒感染，可以确诊。
（二）媒介标本检测。
1．标本处理
将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点，每10～20只为一份进行研磨处理。
2．病毒核酸检测
用RT-PCR的方法进行寨卡病毒核酸检测
3．病毒分离
病毒核酸阳性的标本进行病毒分离。
㈡ 猪圆环病毒2型与猪附红细胞体混合感染的诊断与防治
猪圆环病毒2型与猪附红细胞体混合感染的诊断与防治
税光伟 韩旭 张成伟 洪洋 魏攀 指导老师：赵光伟
西南大学荣昌校区动物医学系，荣昌 402460
摘要:随着我国养猪业集约化程度的提高，生猪和种猪跨地域运输越来越频繁，使得猪群传染病的发生越来越复杂。在很多猪场，都同时存在多种病原的混合感染。2009年1月四川隆昌某猪场送检病猪3头。该场中部分猪只陆续发生高热、皮肤发绀、呼吸困难等症状，病程一般持续5～7天，发病猪一般以死亡为转归。不同年龄段的猪群中均有不同程度的发生，临床表现基本相似。通过临床症状和病理剖检，疑似猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪附红细胞体（E.suis）混合感染。据此笔者在西南大学荣昌校区动物疾病快速诊断中心做了确诊实验。
关键词:圆环病毒2型 附红细胞体 混合感染 综合防治
Diagnosis and Treatment
of Porcine circovirus type 2 mixed infection Eperythrozoon
Shui Guang Wei
Southwest China Normal University of Rongchang campus veterienary medicine department, Rongchang 402460, China
Abstract: Along with our country pig-breeding instry intensification degree's enhancement, the live pig and the kind of pig cross region transportation is getting more and more frequent, causes the pig group infectious disease's occurrence to be getting more and more complex. In many pig farms, simultaneously has many kinds of causes of disease the mixed infections. In January, 2009 Sichuan Longchang one pig farm deliver examines the sickness pig 3 heads. This partial pigs only one after another have symptoms and so on high fever, skin cyanosis, scant of breath, the course continue generally for 5~7 days, the morbidity pig take die generally as the extension turn over. In the disparity in age section's pig group has the varying degree occurrence, clinical manifestation basic similar. Split through the clinical symptoms and the pathology examine, I doubt that the sickness pigs mixed infection with PRRSV virus、PCV-2 virus 2 and E.suis. According to this,We decide to finish it in the southwest university of Rongchang campus animal disease fast diagnostic center.
Key word: Porcine circovirus type 2 Eperythrozoon Mixed infection Integrated Control
1 材料与方法
1．1Bio-Rad PCR仪、菲恰尔（GL-16A）离心机、JUNYI紫外灯（JY04S-3C）、苏静安泰超净工作台、Pipet.Lite微量可调移液器等。所有实验均在西南大学荣昌校区动物疾病快速诊断中心进行。
1．2猪圆环病毒（PCV）核酸扩增检测试剂盒、猪蓝耳病病毒（PRRSV）核酸扩增检测试剂盒均购自北京索奥生物技术有限公司。
2 临床症状
2．1病猪体温41～42℃，稽留热、精神沉郁、皮毛粗乱、心跳和呼吸加快、双侧性震颤，耳部、腹下、腹股沟、四肢出现不规则的紫斑，指压不褪色，有较浓的眼屎、眼结膜苍白、厌食或不食、呼吸困难、后躯无力、行走摇摆，病猪初期便秘，呈粪球状，小便深黄色，发病后期下痢和便秘交替出现。
3 病料采集
对濒死期的或刚刚死亡的猪进行仔细剖检，无菌操作下分别采集心血、肝、脾、肾等病料，供实验室检测用。
4 细菌学检查
4．1血液压片 取抗凝血或鲜血一滴，加3－4倍生理盐水稀释，盖上盖玻片，1000倍油镜下观察，可见大多数红细胞边缘呈锯齿状、星芒状或不规则状，并有微微颤动，即可诊断为附红细胞体感染阳性。判定标准:在油镜下检查20个视野，有25个以下附红细胞体的为感染+，有25－50个附红细胞体的为感染++，有50－70及70以上个附红细胞体的为感染+++。
4．2组织涂片 将无菌采取的肝、脾、肾及淋巴结涂片，革兰氏染色镜检。
5 PRRSV和PCV－2的PCR检测
5．1核酸提取 病料RNA和DNA的提取分别用Trizol reagents(RNA提取液)和核酸提取液B（DNA）提取，按照说明书提供的方法进行。首先将血清稀释，取100ul释出血清加入500ul Trizol reagents（RNA提取液）充分震荡，混匀后室温放置5min。加入100ul氯仿，用力振荡15s，室温静置10min，4℃13，000 rpm离心5min。小心将上层水相转移到干净的离心管，加入等体积的异丙醇，充分混匀，13，000 rpm离心5min。弃上清，加入75％DEPC 乙醇，充分混匀，13，000 rpm离心5min，小心吸去大部分乙醇。将提取管口敞口在室温空气中干燥5min，待乙醇挥发干净，用20ul DEPC H2O溶解沉淀。
5．2逆转录 根据标本数取逆转录反应管，取2ul上述获得的RNA并加入7ul PRRSV－SM RT MIX引物进行逆转录。PRRSV 逆转录的反应体系为25ul，反应条件为：30℃5min，42℃45 min后98℃5min灭活转录酶。PCV－2 PCR检测则省去RNA提取与逆转录步骤，直接进行相应的扩增。
5．3扩增PCR PRRSV PCR扩增的反应体系为25ul。PRRSV PCR扩增反应条件为：94℃变性2min,93℃→2min，93℃ 30 s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35个循环；PCV-2 PCR扩增反应条件为：93℃→2min，后93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35个循环。
5．4电泳检测 取15ul PCR扩增产物直接用加样枪点样于2％琼脂糖凝胶胶孔中，以5 v/cm电压，1 x TAE中电泳20min后，紫外灯下观察结果。用DL2000 Marker作为参照。PRRSV和PCV－2的阳性扩增带分别为396bp和143bp。
6 结果
6．1剖检变化 濒死期病猪的典型表现为：病猪尸体消瘦，不同程度的贫血和黄疸，体表皮肤、粘膜黄染，血液稀薄呈水样；皮下水肿，呈黄白色；体表和肠系膜淋巴结充血、出血和水肿；淋巴结肿大4～5倍，切面外翻，尤以腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管和支气管淋巴结明显，切面多汁呈黄色；肺部的病变主要是肿胀、间质增宽，有散在的橡皮样硬块；肝脏变性且有轻微黄疸、肿大，呈黄棕色；脾脏肿大；肾脏水肿，颜色呈灰白色，覆盖有小出血点。部分病猪心肌变软，心包积液。
6．2细菌学检查结果
6．2．1血液压片 1000倍油镜下观察，可见大多数红细胞边缘呈锯齿状、星芒状或不规则状,诊断为附红细胞体感染阳性，标记为：+++,结果见图2。
6．2．3组织涂片 革兰氏染色镜检，未见细菌。
6．3电泳检测结果：猪圆环病毒（PCV－2）为阳性；蓝耳病病毒（PRRSV）检测为阴性。结果见图1。
图1 PCV-2和PRRSV PCR检测结果 图2 血液压片油镜观察
M：DL2000 Marker；1：PCV-2 PCR产物；2：PRRSV PCR产物
7 防治措施
7．1该病目前尚无疫苗预防，改进饲养管理，对发病严重的病猪立即淘汰，发病轻微的猪进行隔离治疗。用2％ ～3％的烧碱对猪舍进行彻底消毒，保持猪舍饲养用具的清洁卫生；切断附红细胞体病的传播途径。给予全价饲料增加机体的抗病能力，减少不良应激的发生。改进饲养管理，减少应激是控制继发感染的关键。特别是仔猪断奶后的3～4周是预防该病最关键最有效的时期，要降低饲养密度，尽量减少猪群的应激因素，做好猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪蓝耳病疫苗的接种工作，做好猪群平时药物预防工作，母猪在产前1周和产后1周在饲料中可添加土霉素等抗菌药物，仔猪在断奶前1周至断奶后1个月在饲料中可添加强力霉素等抗菌药，同时也拌料一些有预防作用的中药，如清温败毒散进行预防，以减少该病在猪群中流行。
7．2猪圆环病毒是猪的免疫抑制性疾病，引起和继发感染的疾病已成为世界养猪业的大敌。目前仍无有效防治措施，采取的方法是控制继发感染，特别要加强断奶仔猪的营养和管理，采取药物预防，降低猪群死亡率，减少经济损失。
7．3对症治疗
7．3．1治疗圆环病毒病目前尚无特效的治疗药物，应早发现，早确诊，早治疗。对发病不严重的猪只，选用新型的抗病毒剂如干扰素、白细胞介导素、免疫球蛋白、转移因子等进行治疗；同时采用黄芪多糖注射液并配合Vb1、Vb12、Vc肌肉注射，增强猪自身免疫力；另外，也要采用抗菌药物，控制继发感染，如氟苯尼考、阿米卡星、盐酸林可壮观霉素等配合治疗，尽量少用磺胺类药物和地塞米松进行治疗。
7．3．2目前对猪附红细胞体病疗效较好的药物有长效土霉素，四环素，贝尼尔等，按说明剂量肌注24h后，可见临床症状改善，连用3～5d。另外，对阳性猪群的贫血猪，可应用铁制剂(右旋糖酐铁)、土霉素、Vb12、VC等对症治疗。
8 小结与讨论
8．1此次疫病根据流行病学、临床症状和剖检变化及实验室诊断，最后确诊为猪圆环病毒2型与附红细胞体混合感染。
8．2猪圆环病毒病是由猪圆环病毒感染所引起的以免疫抑制为特征的一类病毒性传染病。PCV-2感染新生仔猪及断奶仔猪，使仔猪发生先天性震颤和断奶后全身消耗性综合征，是一种慢性消耗性疾病，导致断奶仔猪生长缓慢、发育障碍、机体免疫力下降、易继发其他疾病(附红细胞体病、弓形体病、猪瘟等)而加重病情。要抓住关键时期，减少应激，仔猪断奶后3～4周，是预防圆环病毒的最关键时期，最有效的方法和措施是尽可能减少断奶仔猪的应激。经分析，猪长途贩运，使动物机体产生一定的应激反应，加上抵抗力下降，特别是感染附红体和弓形体病后，进一步降低机体的免疫力，当遇到传染性疾病流行时，特别是遇到猪圆环病毒感染侵袭，就会造成病猪死亡率增高。
8．3猪附红细胞体病是由猪附红细胞体引起猪的一种血液病，蚊虫是重要的传播媒介，尤其在多雨季节蚊虫易孳生，加上猪群感染圆环病毒，机体抵抗力下降，而发生猪附红细胞体病。防治该病应消灭蚊虫，切断传播途径，加强器械的消毒，提高管理水平。从现在的季节来看，正是春季，气温时高时低，忽热忽冷，春季又是病菌活动频繁季节，所以加快了疫病流行。另外，老鼠可传播多种疾病，若鼠害控制不力，则易引起疾病的发生，因此，必须控制鼠害。
8．4为了减少疾病的发生，规模化养猪场必须坚持自繁自养，做到全进全出，加强平时消毒工作，这样尽可能地避免或减少疫病的传入和流行。
8．5附红细胞体病的死亡率很低，但与猪圆环病毒混合感染后，死亡率就会显着上升，可达60％以上，这也是造成病猪死亡率增高的重要原因。采用综合措施后，该猪场的病情基本稳定，得到了有效控制，到2月下旬逐渐恢复正常。
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