蛋白质n端测序方法有哪些

1. 蛋白质多肽链N端测定的方法及基本原理

1 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
2 测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
3 二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
二硫键的切割与保护（元素后数字为下标）
a 过甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、还原＋氧化 不可逆
[ 巯基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。
巯基（-SH）的保护4 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比（如右图）
5 分析多肽链的N-末端和C-末端
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氢化锂法）。
6 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。
7 测定每个肽段的氨基酸顺序
8 确定肽段在多肽链中的次序。
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
9 确定原多肽链中二硫键的位置
一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。

2. 常用于蛋白质多肽链N端.C端测定的方法有几种

(1)N-末端测定
A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一.
DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸.Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸.
B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法,步骤如下：
由于乙内酰脲氨基酸不带电荷,因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开,分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解,重新生成游离的氨基酸,鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸.
C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯.它与游离氨基末端作用,方法类似于Sanger的DNFB法,产物是磺酰胺衍生物.
丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光.此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定.
(2)C-末端分析
A.肼解法：这是测定C-末端最常用的方法.将多肽溶于无水肼中,100℃下进行反应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放,而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼.
这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析.如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺,则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸.此外肼解时注意避免任何少量的水解,以免释出的氨基酸混淆末端分析.
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸.根据酶解的专一性不同,可区分为羧肽酶A、B和C.应用羧肽酶测定末端时,需要事先进行酶的动力学实验,以便选择合适的酶浓度及反应时间,使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸.

3. 蛋白质N端测序的测定蛋白质N端序列的方法

目前对蛋白N端测序主要分类两大类，其一为非质谱技术，例如经典的Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列；其二为质谱技术。各自都有其使用的长处和制约之处，目前，市面上采用的，依然是基于经典的Edman降解法原理，利用美国ABI公司Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N-端测序。

4. 蛋白质N端和C端的测定方法是什么基本原理是什么

n端测序的原理
蛋白质和多肽n-端测序技术是以edman化学降解法为基础的，edman化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的n-端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（ptc-肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨（atz）转化为苯异硫尿氨基酸（pth-氨基酸）三个主要的化学步骤，每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个edman降解，最后通过转移的pth-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。
蛋白质c端测序3种方法：化学法、羧肽酶法、及串联质谱法
其中后两者最近普遍应用的办法。
羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶a、b和c。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时...n端测序的原理
蛋白质和多肽n-端测序技术是以edman化学降解法为基础的，edman化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的n-端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（ptc-肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨（atz）转化为苯异硫尿氨基酸（pth-氨基酸）三个主要的化学步骤，每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个edman降解，最后通过转移的pth-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。
蛋白质c端测序3种方法：化学法、羧肽酶法、及串联质谱法
其中后两者最近普遍应用的办法。
羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶a、b和c。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是c末端氨基酸。
串联质谱法
串联质谱法原理：即在质谱中获得蛋白质肽段的碎片。肽段在质谱中的碎裂有一定规律，通常最容易断裂的是肽键位置，得到分别命名为b离子和y离子，得到这些离子的m/z的图谱，分析图谱得到的蛋白质的c端序列。

5. 蛋白质一级结构测定中,鉴定N-末端的常用方法

1 二硝基氟苯法（Sanger法)
2 苯异硫腈法（Edman法）
3 二甲基氨基萘磺酰胺法（DNS法）
4 氨肽酶法

6. 常用于蛋白质多肽链N端.C端测定的方法有几种

(1)N-末端测定 A.二硝基氟苯(FDNBDNFB)：1945Sanger提重要贡献DNP-氨基酸用机溶剂抽提通层析位置鉴定何种氨基酸Sanger用测定胰岛素N末端别甘氨酸及苯丙氨酸B.氰酸盐：1963Stank及Smyth介绍种测定N末端新步骤：由于乙内酰脲氨基酸带电荷用离交换层析与游离氨基酸离所乙内酰脲氨基酸再盐酸水解重新游离氨基酸鉴别氨基酸即解N-末端何种氨基酸C.二甲基氨基萘磺酰氯：1956Hartley等报告种测定N-末端灵敏采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯简称丹磺酰氯与游离氨基末端作用类似于SangerDNFB产物磺酰胺衍物丹磺酰链酸具强烈黄色荧光优点灵敏性较高(比FDNB提高100倍品量于1毫微克)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(酸水解稳定性较DNP氨基酸高)用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定(2)C-末端析A.肼解：测定C-末端用肽溶于水肼100℃进行反应结羧基末端氨基酸游离氨基酸状释放其余肽链部与肼氨基酸肼羧基末端氨基酸采用抽提或离交换层析其进行析羧基末端氨基酸侧链带酰胺冬酰胺谷氨酰胺则肼解能产游离羧基末端氨基酸外肼解注意避免任何少量水解免释氨基酸混淆末端析B.羧肽酶水解：羧肽酶专性水解羧基末端氨基酸根据酶解专性同区羧肽酶A、BC应用羧肽酶测定末端需要事先进行酶力实验便选择合适酶浓度及反应间使释放氨基酸主要C末端氨基酸

7. 蛋白质N端和C端的测定方法是什么基本原理是什么

蛋白质N端和C端的测定方法是什么？基本原理是什么
二硝基氟苯法(FDNB法) 2、二甲基氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法) 3、异硫氰酸笨酯法(Edman法) C-末端分析1、肼解法 2、还原法