目的基因的克隆的方法有哪些

㈠ 已知一个物种的基因组,怎么克隆目的基因

这个呢一般的做法就是首先构建基因文库或者cDNA文库， 基因文库和cDNA文库建立起来后，下一步的工作是从一个庞大的基因库中分离出所需要的重组体克隆，这是一件难度很大，费时费力的工作。一种方法是根据重组体某种特征从库中直接挑选出重组体，这种方法叫做“选择”；另一种方法是把库中所有的重组体进行一遍筛查，这种方法叫做“筛选”。

1.原位杂交法：这一种利用特异探针的直接选择法，是一种十分灵敏而且快速的方法，用于杂交的探针可以是双链DNA，也可以是单链DNA，或是RNA。杂交的检测常用放射性同位素标记探针，通过自显影来进行。显然，有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针。探针的获得有如下方法：
①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探针可以从已有的克隆中制备，或用PCR方法扩增。
②如果目的基因是未知的，而有其他物种的同源序列，那么可以用同源序列做探针。
③如果目的基因未知，
但知道它对应的蛋白质序列，
可根据蛋白质序列设计相应的核酸探针。

2．扣除杂交法：这是一种筛选方法，难度很大，是面对目的基因未知，同源基因未知，蛋白质序列未知的情况的。基本原理是找到该基因的高表达细胞，提取相应的mRNA，并与一般细胞提取的mRNA进行比较，分离一般细胞不存在而高表达细胞存在的mRNA，然后用该mRNA逆转录生成cDNA。

另外，若目的基因已知的话，简单的PCR扩增就行了。

㈡ 基因克隆的方法主要有哪几种，简述各种方法的原理和用途

基因克隆的方法主要有哪几种
选择目的基因,并设计相应引物；
用引物PCR扩增目的基因片段；
选择合适（抗性标记、酶切位点等）的克隆载体（为了保真扩增）,并将PCR片段连接入克隆载体中；（一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A,可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连）
将连接产物转化入感受态大肠杆菌,使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；
从大肠杆菌中提取质粒（即前面的连接产物）,酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接,然后再次转化入大肠杆菌中扩增,再提质粒,即得到想要的目的基因片段克隆.

㈢ 目的基因的制备方法有哪些

获取目的基因的方法主要有两种：

1、从供体细胞的DNA中直接分离基因，最常用的方法是“鸟枪法”又叫“散弹射击法"。

2、人工合成基因：以目的基因转录的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，再在酶的作用下合成双链DNA，即目的基因，另一条途径是蛋白质的氨基酸序列，推测出信使RNA序列，再推测出结构基因的核苷酸序列，然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成。

在基因克隆过程中目的基因就是要分离、纯化、克隆并转化到生物体的那个可以带来预期表型性状如抗虫或耐除草剂的基因。

(3)目的基因的克隆的方法有哪些扩展阅读：

目的基因可以是生物体本身的， 也可以是来自不同生物体的。比如Bt基因来自苏云金芽孢杆菌。

目的基因被成功地转化并整合到受体细胞本身不能保证基因在新的遗传环境中能得到准确的表达。必须进行测试以确定是否存在表达，在实际应用中，只有那些以足够高的水平表达目的基因的转基因生物才是有意义的。

如果转基因后代分离比例不符合孟德尔遗传规律，转入的外源基因有可能干扰了内源基因的表达。另一个原因是在受体基因组中的不同位点整合了两个或更多个转基因拷贝。这些都要进行育种试验确认。

㈣ 基因克隆的方法有哪些

简单的说一下：
扩增目的基因，比如通过PCR的方法。
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。
转染大肠杆菌
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。
挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

㈤ 怎样克隆一个目的基因

目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。

常用的植物目的基因克隆技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定
这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。
2、通过遗传表型分析
（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。
（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共’�虮嗦氲氖芴逯�浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担�圆≡�し⒆拥鞍孜�咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共’�颍�绶�延胛薅净�騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。
3、以图谱为基础的定位克隆技术
以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。

㈥ 基因克隆常见方法

、T4连接酶介导的DNA克隆

传统的分子克隆，通常需要使用相同的限制性内切酶酶切载体和目的片段，使得载体和片段产生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA连接酶对其进行连接，转化，挑取阳性克隆，得到重组质粒

为了更方便的对DNA进行克隆，后续又将克隆的载体进行了简化，出现了T载体，这样就可以不用酶切，直接将片段连接到载体上，以便于DNA的保存及后续扩增。

以TA克隆为例来介绍整个连接过程。常规的连接是一个三分子共同反应的过程（图1），载体、片段和连接酶碰撞在一起，发生反应，完成连接过程。为了得到更多的阳性克隆，我们会倾向于加入更多的片段、载体和连接酶，以提高分子碰撞机率，但同时也会遇到一个问题，过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间相互作用促进串联体和载体自连的形成，反而导致片段和酶的利用率降低。所以在进行TA克隆时，并不是DNA和酶加入的越多越好。

使用这种方法进行克隆，如果需要连接平末端的DNA片段（比如Pfu类酶扩增的片段），则需要进行额外的加A尾反应（可以使用Taq酶完成加A）

二、EASY克隆

EASY克隆的方法主要依赖于载体上所携带的拓扑异构酶。拓扑异构酶的生理作用主要体现在DNA复制的过程中，同时具有内切酶和连接酶的功能：酶切释放DNA复制过程中产生的螺旋力；在复制完成后，将缺口补上，完成DNA的复制。很多拓扑异构酶无明显特异性结合DNA序列的规律，直到1990年，科学家舒曼在牛痘病毒中发现了一种拓扑异构酶能特异性识别C/TCCTT序列（图2），并对后面序列进行切割和连接，才使得拓扑异构酶用于DNA克隆成为可能。

图2 左图：拓扑异构酶识别特定的序列；右图：拓扑异构酶介导的基因克隆

EASY克隆就是基于这一原理，将T碱基通过磷酸键与拓扑异构酶第274位酪氨酸结合，使拓扑异构酶和载体偶联在