蛋白生物素化的方法有哪些

A. 五种蛋白质-蛋白质相互作用的方法，简述其中一个原理。

蛋白质分子的相互作用：一、生物大分子的相互作用：生物大分子发挥生理功能所需的三个条件：分子结构、分子运动和变化以及分子间的相互作用。 1、非共价键的左右：离子键、氢键、范德华力和疏水键。信息的传递以及利用极大地以来弱的非共价键。它们不仅决定着生物的大分子的三维结构，还决定着这些结构如何与其他结构相互作用。 2、作用力特点：分子的结合与解离二、蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质之间相互作用的结构模式：通过蛋白质的模体或基元或者结构域而发生作用。三、DNA-蛋白质相互作用：两者之间相互作用的化学键 1、氢键：具有识别功能蛋白质的螺旋结构常与DNA的大沟相互作用。 2、疏水键：暴露于大沟侧源的T-CH3集团是疏水性的，可与疏水氨基酸残基侧链相互作用。 3、离子键蛋白质也属于生物大分子，存在氢键、范德华力和疏水键由于这几种作用力的存在，使得蛋白质更加稳定。

B. gbs生物活化素

生物素的活化与活化生物素的标记2007-01-12 03:33 1． 生物素的活化
生物素预先活化后，通过噻吩环的戊酸侧链上羧基与抗体、酶等生物大分子以酰胺键偶联。活化生物素的制备是获得高敏感度BAS制剂的关键环节。常用方法有以下几种：
1） 生物素N—羟基丁二酰亚胺酯（biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS）的制备：
取生物素1g混悬于12 ml，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加人0．6g N-羟基丁二酰亚胺(HOSU)和0. 8 g二环己基碳二亚胺(DCC)，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用过夜。过滤，滤液经旋转蒸干。加10mL乙醚洗涤，继加200 ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体。
BNHS酯键中的-C=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基结合，使生物素标记在蛋白分子上，含赖氨酸残基越多，或蛋白质的等电点在pI 6.0以上，其标记效果越好。因此，BNHS适用于标记抗体及中性和偏碱性的抗原。
2）长臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制备
生物素的分子量仅为244.31，当与抗体或酶结合后应用于免疫试验时，极易受到大分子蛋白空间位阻效应(steric hindrance)的影响。使用长臂生物素可以减少位阻效应，提高试验的灵敏度。长臂生物素是在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加2分子6－氨基己糖，犹如给生物素分子增添一只手臂，使其不受位阻效应影响，更易与抗体、酶等生物大分子结合而发挥作用、BCNHS的制备过程分为两步：先制成长臂生物素，然后再使其活化。
长臂生物素的制备：称取BNHS 3 41 mg ,6-氨基己糖盐酸盐200mg，溶解于5mLDMF，再加入0.152 mL三乙胺(TEA)，室温搅拌下作用20h。蒸发去除DMF，加l mmol/L NaOH 3mL，继加甲醇至溶液变清，搅拌2h。蒸发去甲醇，加10mL蒸馏水，搅拌下滴加浓盐酸酸化至刚果红指示剂恰好变色。室温静置2h后，移放冰箱过夜。收集白色固体物，干燥后用水重结晶，再经真空干燥，所得物即为长臂生物素，平均获得率为64％。熔点为206-215℃。
长臂生物素的活化：称取长臂生物素357mg溶于DMF10ml 。中，加HOSU 130 mg和适量缩合剂，室温搅拌下作用48h。过滤，收集滤液蒸发干，加乙醚洗涤后，用无水异丙醇10－15ml重结晶。所得粉末状固体即为活化长臂生物素，平均获得率为41％，熔点为156-162℃。
3) 生物素酰肼(biotin hydrazide，BHZ)的制备
BHZ是水合肼(hydrazine hydrate)与生物素的合成物，因在生物素的羧基侧链上带有肼基，故能标记带醛基的蛋白质。
BHZ制备过程：取10生物素和氯化亚砜0.1 ml，在搅拌下缓慢加入冰冷的无水甲醇1ml中。溶解后放置28℃24h，继经真空干燥；加无水甲醇lml，待溶解后再次真空干燥。残余物溶于0.5mL无水甲醇，并缓慢加入水合肼0.1ml，置28℃24h后用滤纸过滤，沉淀物用乙醚20ml反复淋洗，最后用DMF l0 ml淋洗，移置37℃温箱内烘干，放4℃保存备用。
BHZ主要用于标记偏酸性的糖蛋白。如在其侧链上添加1分子赖氨酸作为连接臂，可使生物素免受位阻作用，更易与亲合素结合。
4）肼化生物胞素 (biocytin hydazide ，BCHZ)的制备 生物胞素为ε生物素赖氨酸，是生物素通过C=O基与赖氨酸的ε-氨基连接生成的化合物。BCHZ可与蛋白质的醛基和氨基结合，优于只能与醛基结合的BHZ。
BCUZ制备过程：取生物胞素甲酯100mg溶于甲醇2 ml，加入无水肼0.1 ml，25℃反应48h.浓缩至近乎干燥时，在H2SO4干燥装置中减压抽干，直至只测出少量的肼。产物溶于l ml蒸馏水中，通过聚苯乙烯型色谱固定相Q去肼。BCHZ可在热乙醇中结晶。
2．生物素结合物的制备
经过活化的生物素及其衍生物可以和各种蛋白质(包括抗体、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、荧光素、胶体金等结合；并可借助交联剂与细胞、琼脂糖珠等偶联。广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域，以及作为亲和分离制剂，用于相应配基的分离与纯化。以下重点介绍生物素化抗体、抗原及酶结合物的制备方法。
1）生物素化抗体制备
(1)BNHS溶液lmg／ml以二甲亚砜(DMSO)制备。
(2)将待偶联的抗体溶液以0．1m01／LpH9．0NaHCO。配成1—2mg／m1。
(3)将BNHS与待偶联抗体(如IgG)按1：8混合，室温搅拌4h。
(4)4℃条件下使上述混合液体以o．05m01儿，pH7．2PBS透析过夜，加等体积甘油
或0．02％NaN：一30℃分装存放。
生物素化抗体应避免反复冻融，按使用需量分装小瓶。一旦启封稀释使用，勿继续冻存保留。
2）生物素化辣根过氧化物酶(bio—HRP)制备：
(1)取BNHS(MW454)2．?mg溶于4m1DMF。
(2)以0．1m01儿pH8．4的NaHC02配制5mg／m1的HRP，按BNHS：HRP为1：8
混合(应将BNHS溶液缓慢加至HRP溶液)。置22℃反应4h。；
(3)上述混合液于4℃条件下对0．01m01儿pH7．4PBS透析，48h，中间换液8次以上。
(4)收集透析液加等量甘油混合，或加o．02％NaN，分装，-20℃存放。

C. 生物素-亲合素系统的BAS系统的应用

BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。

第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。 亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
生物素-亲和素系统可以与亲和层析的方法结合，大大提高纯化蛋白质的纯度，或者为已知配体寻找受体。步骤是首先将生物素共价结合到配体蛋白上，再将生物素化后的配体蛋白加入含有受体蛋白的混合物，然后将此混合物通过预先固定了亲和素的层析柱，这时配体受体复合物就通过生物素-亲和素系统停留在层析柱上，最后通过选择性洗脱获得此受体配体蛋白复合物或者仅有受体。这一方法被广泛运用于药物研发行业，当人们发现某种药物分子具有疗效但是又不清楚它具体作用于哪种蛋白质时，可以将其生物素化然后把靶蛋白从成千上万种蛋白质中“抓”出来。
生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离DNA.方法是在DNA探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的DNA片段，再利用固定化的亲和素回收这些DNA。
传统的基因探针是由带放射性的磷酸碱基合成的，我们可以用被生物素标记的磷酸碱基合成基因探针，避免了实验过程中放射性物质可能造成的伤害。

D. 蛋白质的纯化方法有那些呢具体步骤是什么

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

E. 常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种各自的作用原理是什么

分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离。

常见的分离提纯蛋白质的方法有：
1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白质沉淀。2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质，可将大分子物质与小分子物质分离开。4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离。主要有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等，其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。5、分子筛：又称凝胶过滤法，蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。6、超速离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。

F. 蛋白质纯化有哪些方法，如何应用

常用的蛋白质纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱、电泳、疏水色谱等等
离子交换色谱：蛋白质和氨基酸一样会两性解离，所带电荷决定于溶液pH。pH小于pI时蛋白质带正电，pH大于pI时蛋白质带负电。不同蛋白质等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面电荷情况不同。离子交换就是利用不同蛋白质在同一溶液中表面电荷的差异来实现分离的。
亲和色谱：生物大分子有一个特性，某些分子或基因对它们有特异性很强的吸附作用。如镍柱中Ni可以与His标签的蛋白结合，这种只针对一种或一类物质的吸附就是亲和色谱的原理。
电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，
与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
疏水色谱：疏水色谱基于蛋白质表面的疏水区与介质疏水配体间的相互作用，在高浓度盐作用下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏被释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附。疏水色谱就是利用样品中各组分在色谱填料上配基相互作用的差异，在洗脱时各组分移动速度不同而达到分离的目的。随着盐离子浓度的降低，疏水作用降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质被解吸附。