生物活性物质的浓缩方法有哪些

Ⅰ 活性成分总黄酮的提取方法有哪些

总黄酮的提取方法
1、 熔剂法
热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法 2、
2、微波提取法
微波提取是利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异，使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被提取物质从基体或体系中分离，进入介电常数较小，微波吸收能力相对差的提取剂[1]。这种方法的优点是对提取物具有较高的选择性、提取率高、提取速度快、溶剂用量少、安全、节能、设备简单[2]。 2.2 超声波提取法
用超声波提取法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。原理是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外，还利用其次效应，如机械振动、扩散、击碎等，使其加速被提取成分的扩散、释放。超声波提取法具有设备简单，操作方便，提取时间短，产率高，无需加热，同时有利于保护热不稳定成分，省时，节能，提取率高的优点。
3、 超临界流体萃取法
超临界流体萃取技术是利用超临界流体处于临界温度和临界压力以上，兼有气体和液体的双重特点，对物质具有良好的溶解能力，从而作溶剂进行萃取分离。可做超临界流体的物质很多，一般为低分子量的化合物，如CO2、C2H6、NH3、N2O 等。目前多采用CO2 做萃取剂，因为它具有密度大、溶解能力强、临界压力适中、临界温度接近常温、不影响萃取物的生理活性、无毒无味、化学性质稳定、生产过程中容易回收、无环境污染、价格便宜等一系列优点。但单一的CO2作萃取剂只对低极性、亲脂性化合物有较强的溶解能力，对大多数极性较强的组分则不起作用，因此，在其中加入夹带剂，通过影响溶剂的密度和溶质与夹带剂分子间的作用力来影响溶质在二氧化碳流体中的溶解度和选择性[15]。超临界流体萃取技术有许多传统分离技术不可比拟的优点：过程容易控制、达到平衡的时间短、萃取效率高、无有机溶剂残留、对热敏性物质不易破坏等[16]。但它所需要的设备规模较大，技术要求高，投资大，安全操作要求高，难以用于较大 规模的生产。
4、 酶法提取
酶解法适用于被细胞壁包围的黄酮类物质，利用酶反应的高度专一性，破坏细胞壁，使其中的黄酮类化合物释放出来。黄剑波等[22]采用纤维素酶辅助法从甜茶中提取黄酮类化合物，黄酮类物质的提取率为91%，提取纯度为54%。王悦等[23]对桔皮细胞进行游离酶、固定化酶和常规法提取，黄酮得率分别是1.43%，0.94% 和0.79%，和传统的方法相比，游离酶法的总黄酮得率提高了81%。
5、双水相提取法
双水相提取技术是瑞典Per Albersson首先发现并研究 的一种技术，双水相萃取法属于液- 液萃取，当物质进入双 水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力的作用，溶 液环境的影响，其在上、下相中的浓度不同，即各成分在两 相间选择性分配，从而达到萃取的目的。由于双水相体系分 相快、使用温度低、容易操作、无污染、提取率高，因此成 为黄酮化合物富集分离的一种有效方法。张春秀等[24]取一 定量的银杏叶浸提液，加到PEG1500/ 磷酸盐体系双水相 系统中，则黄酮类化合物进入上相PEG，从而将黄酮类化合 物分离，提取率可达98.2%。
6、 半仿生提取法
半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，模拟口服给药后药物经胃肠道转运的环境，为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺。这种提取方法的特点是可以提取和保留更多的有效成分，能缩短生产周期、降低成本。
7、膜分离法
膜分离法主要有超滤、微滤、纳滤和反渗透等，其中超滤法是膜分离的代表，它是唯一能用于分子分离的过滤方法，是以多孔性半透膜为分离介质，依靠薄膜两侧压力差作为推动力来分离溶液中不同分子量的物质。由于大多数黄酮类化合物的分子量在1000 以下，而非有效成分如大多数的多糖、蛋白质等分子量多在50000 以上，因而使用超滤能有效去除蛋白质、多肽、大分子色素、淀粉等，达到除菌、除热原、提高药液澄明度以及提高有效成分含量等目的。这种方法操作简便、不需要加热、不损坏黄酮类化合物，提取效果好、超滤装置可反复使用。于涛等[26]研究了银杏叶中黄酮类化合物的提取过程及工艺，使用超滤技术对粗提的产品进行精制，对影响超滤的工艺条件进行了考察，超滤后产品中黄酮质量分数达到33.99%。
8、 热压流体萃取法
热压流体萃取法是一种快速、环保、便宜、有效地萃取生物活性物质的方法。Chaorui Chen等[27]采用热压流体萃取法从巴西蜂胶中提取了7种黄酮类化合物，结果表明，通过热压水萃取的样品中当存在表面活性剂时萃取物的固体含量更高，当使用热压脂溶萃取时，7种黄酮类化合物的含量在脂溶萃取中超过了水溶萃取。KairHartonen等[28]用热压水萃取法从白杨中萃取了黄酮类化合物，考察了萃取时间、温度和压力等因素的影响，并与超声波萃取、高速逆流色谱做了比较，结果表明用热压水萃取法在150℃萃取35min效 果最好。
2.9 高压液相提取法
Ying Zhang等[29]通过高压液相萃取法从鱼腥草中萃取了黄酮类化合物，研究了乙醇浓度、流速、温度和压强等因素的影响，并与热浸法和超声波辅助萃取法进行对比，发现高压液相萃取法提取效果较好，当使用50% 乙醇，溶剂流速为1.8mL/min，温度为70℃，压强为8MPa 时，黄酮类化合物的得率和浓度可以达到3.152% 和23.962%

Ⅱ 什么物质和5'AMP混合难于萃取分离但通过多次萃取又能分离

现代生物制药工艺学上课讲义（2）

第二章 生物制药工艺技术基础
第一节 生物材料与生物活性物质
一、生物材料的来源
供生产生物药物的生物资源主要有动物、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用动植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生物制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生物制药资源的新途径。
（一）动物脏器
（1）胰脏 （激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）
（2）脑 （脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）

（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）
（4）肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）
（5）脾脏（免疫器官）
（6）小肠（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）
（7）脑垂体（各种激素）
（8) 心脏（细胞色素C、辅酶Q10）
其它等
（二）血液、分泌物和其它代谢物
血液制品：人血制剂、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。
尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、HCG

（三）海洋生物
（1）海藻
（2）腔肠动物 海葵毒素
（3）节肢动物 甲壳素
（4) 软体动物 多糖、多肽、毒素
（5）棘皮动物 海星、海胆、海参 海参素抗癌
（6）鱼类 鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素
（7）爬行动物 龟 滋阴养肾 抗肿瘤
（8）海洋哺乳动物 鲸鱼鱼肝油
（四）植物
生物碱、强心甙、黄酮、皂甙、挥发油、树脂、鞣质等。

（五）微生物
1.细菌
常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：
（1）氨基酸
利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。
（2）有机酸 柠檬酸、苹果酸、乳酸
（3）糖类 利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。
（4）核苷酸类 用细菌可生产5‘－AMP，5’－肌苷酸
（5）维生素 VB1,VB2，VB6, Vc
（6）酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶

2.放线菌
放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。
（1）氨基酸 发酵法
（2）核苷酸 5-脱氧肌苷酸
（3）维生素
（4) 酶
3.真菌
（1)酶
（2）有机酸
（3）氨基酸
（4）核酸及有关物质
（5）维生素
（6)促生素
（7）多糖

4.酵母菌
（1）维生素
（2）蛋白质与多肽
（3）核酸

（六）开发生物新资源
（1）动植物细胞的大规模培养
（2）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞

二、生物活性物质的存在方式
（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能
根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。
（二）生物分子间的作用力

三、生物活性物质的存在特点
（一）生物材料组成的复杂性
（二）生物活性物质存在地特点
生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。
生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。

四、生物材料的准备
生物材料的制造主要包括以下工艺过程：
1)生物材料的选取与预处理；
2)从生物材料中提取有效活性物质；
3)有效成分的分离，纯化
4)后处理及制剂

（一）生物材料的选取
1.有效成分的含量
（1）生物品种
根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）

（2）合适的组织器官 （胃蛋白酶，胃）
（3）生物的生长期
生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。
2.杂质情况
难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。
3.来源
应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。
胰脏 制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。

（二）生物材料的采集与保存
生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。
保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。
（三）动物细胞的培养与保存
（四）微生物菌种的选育与保存
1.菌种的分离
微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。
（1）含菌样品的收集
根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。

到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。
一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2~3cm，在同一条件下选好2~5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。
（2）富集培养
收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，pH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。
（3）菌种纯化
在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。

2.菌种的筛选
（1）筛选对象的选择
筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。
（2）培养方式的确定
微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。
3.菌株的选育
从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。
（1）随机选择法
一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。
（2）根据代谢的调节机理选择高产突变体
根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因)
4.菌种的保藏
（1）菌种的退化与防止
生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。
退化—一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。
菌种退化现象：①单位容积中发酵液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气味、色泽。

菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。②采用双重缺陷型 采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。③制定科学管理制度 制作平行菌种斜面；④分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；⑤选择培养条件 选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。
（2）常用的菌种保藏方法
斜面保存法—将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于4℃保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。
矿油法—在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。
索氏法—将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。

干硅胶法—试管内装硅胶约半满，180℃加热灭菌1.5小时，置密封干燥器内冷却，接种菌液约1ml，塞好棉花，放入预置有色硅胶的大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。
砂土管法—取普通黄沙，洗净过60目筛，晒干，另取普通圆土研碎，过筛，晒干。两者以6:4混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在60℃干热灭菌2小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少许孢子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。
冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。
甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存于－70~－80℃.

（五）组织与细胞的破碎
组织与细胞的破碎方法有物理法、化学法与生物法。
1.物理法
（1）磨切法
工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。
（2）压力法
有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。
（3）超声波法
（4）反复冻融法
2.化学法
用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。

3.生物法
（1）组织自溶法
利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。
(2) 酶解法
用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等
（3）噬菌体法
用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。
（六）细胞器的分离
为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。

第二节 生物活性物质的提取
提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。
一、物质性质与提取
（一）物质的性质与提取方法的选择
要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。
生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性质，有关酶的特征等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。

（二）活性物质的保护措施
（1）采用缓冲盐系统
在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。
（2）添加保护剂
防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，－巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA。
（3）抑制水解酶的作用

二、物质的性质与溶解度
（一）物质溶解度的一般规律
相似相溶
（二）水在生化物质提取中的作用
水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。
三、提取效率

（4）其它保护措施（冷、热、酸、碱）

四、影响提取的因素
（一）温度
多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌，所以对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在0~10℃进行提取。
(二)酸碱度
多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在4～9范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。
巧妙地选择溶剂系统的pH值不但直接影响目的物与杂质溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收率。

（三）盐浓度
盐溶作用
盐析作用

五、提取方法
（一）用酸、碱、盐水溶液提取
（二）表面活性剂提取
表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。

（三）有机溶剂提取
1.固－液提取
丙酮从动物脑中提取胆固醇，
溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。
丙酮粉
2.液－液萃取
液－液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量
溶剂萃取的注意事项：
（1）pH
在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。

（2）盐析
加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。
（3）温度
一般在室温下或低温下进行萃取操作。
（4）乳化
在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。
液液萃取时溶剂的选择：
（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。
（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。

(3)两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。
（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。
第三节 生物活性物质的浓缩与干燥
一、生物活性物质的浓缩
（一）盐析浓缩
硫酸铵沉淀蛋白质
（二）有机溶剂沉淀浓缩
在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。
（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩
（四）用聚乙二醇透析浓缩

（五）超滤浓缩
（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩
真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。
薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。使液体形成薄膜而蒸发，成膜的液体具有较大的表面积，热传播快而均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止物料的过热现象。
二、干燥
干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理。
表面水，毛细管中的水，细胞内的水

（一）减压干燥
（二）喷雾干燥
（三）冷冻干燥
第四节 生化物质的分离纯化方法
一、生物制药中分离制备方法的特点
生物制药中分离、制备方法有以下特点：
（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。
（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。
（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（难点）

（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH，离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。
（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。
（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。
二、生物制药中分离制备方法的基本原理
生物大分子分离纯化的主要原因：
（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。
（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。

（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。
（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。
（5）根据配体特异性进行分离—亲和层析法。
三、分离纯化的基本程序和实验设计
生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致上分为五个基本阶段。
（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。
（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。
（3）材料处理及抽提方法的选择。
（4）分离纯化方法的摸索。
（5）产物均一性测定。

提取是分离纯化目的物的第一步，所选的溶剂应对目的物具有最大的溶解度，并尽量减少杂质进入提取液。
分离纯化是生化制备的核心操作。分离策略：
1.分离纯化早期使用方法的选择
分离纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。
一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高。
2.各种分离纯化方法的使用程序

生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要依据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。而每一种方法又都是在特定条件下发挥作用。因此，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。
在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。（盐析－吸附，吸附－盐析）
对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。
3.分离后期的保护性措施
在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。

四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价
每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。
对每一步骤方法的优劣，体现在所得产品重量与活性平衡关系上。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。
五、制备物均一性的鉴定
均一性是指所获得的制备物只有一种完全相同的成分。（纯度鉴定）
生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法。

第五节 生物制药中试放大工艺设计
一、生物制药中试放大工艺特点
中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要。这些研究工作都是围绕如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。中试放大，验证实验室工艺路线的可行性以及在实验室阶段难以解决或尚未发现的问题。
在考查工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决：
（1）原辅材料规格的过渡试验
在小试时，一般采用的原辅材料（如原料，试剂，溶剂，纯化载体）规格较高，目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响，从而保证实验结果的准确性。但是当工艺路线确定之后，在进一步考察工艺条件时，应尽量改用大规模生产时容易得到的原辅材料。过渡试验

2.设备选型与材质质量试验
在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进行，但在工业生产中，物料要接触到各种设备材料，如微生物发酵罐，细胞培养罐，固定化生物反应器，多种层析材料以及产品后处理的过滤浓缩、结晶、干燥设备等。
3.反应条件限度试验
反应条件限度试验可以找到最适宜的工艺条件（如培养基种类，反应温度，压力，pH等），一般均有一个许可范围。有些反应对工艺条件要求很严，超过一定限度后，就会造成重大损失。进行工艺条件限度试验，全面掌握反应规律。
4.原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究
5.下游工艺的研究
尽量简化下游工艺操作，采用新工艺，新技术，新设备等。

二、中试放大方法与内容
中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。经验放大法主要凭借经验通过逐级放大（实验装置，中间装置，中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。
中试放大程序可采用步步为营或一竿子到底策略。
中试放大的研究内容主要有：
（1）工艺路线与各步反应方法的最后确定
（2）设备材质与型号的选择
（3）反应器的规模选择及反应搅拌器型式与搅拌速度的考查。
（4）生产反应条件的研究
（5）工艺流程与操作方法的确定

（6）物料衡算
（7）安全生产与三废防治措施研究
（8）原辅材料，中间体的物理性质和化工常数的测定
（9）原辅材料、中间体质量标准的制定。
（10）消耗定额，原料成本，操作工时与生产周期计算。

生产工艺规程的制订

Ⅲ 如何提取得到具有生物学活性的RNA

提取得到具有生物学活性的RNA的方法：

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

在过去的十年中

RNA-Seq技术迅速发展，并成为了在转录组水平上分析差异基因表达/mRNA可变剪切的不可缺少的工具。随着下一代测序技术的发展，RNA-Seq技术应用范围变得更加广泛：在RNA生物学领域，RNA-Seq可以应用于单细胞基因表达/蛋白质表达/RNA结构的分析；空间转录组的概念也逐渐兴起。

Ⅳ 浓缩DNA方法有哪些(至少三种)

鄙视楼上的答非所问！
三种方法：
1，沉淀后复溶；
2，吸附后洗涤；
3，冻干

Ⅳ 生物活性物质主要有哪些提取方法

植物的活性物质的提取多采用：溶剂法、水蒸汽蒸馏法、超临界二氧化碳提取分离法、萃取法。分离多用硅胶柱色谱法。动物的生理活性物质提取分离比较复杂，方法多种：如盐析法、电泳法、高速离心法、受体识别法等。

Ⅵ 微生物活性物质分离纯化步骤或流程图、急!!!!!!!!!!!

你可以考虑以下几方面：
1）初步确定你的发酵液中的活性成份的性质，HPLC显示都是极性非常强只是说明它的水溶性很好，不足以判断它的性质；你可以查阅质料，看一下相关的菌种产生的活性物质的种类，然后设计相关的实验来进行初步验证，比如抗生素能产生抑菌圈，蛋白酶能水解蛋白质底物形成透明圈等相关实验；
2）根据活性成分的性质来设计分离纯化的方法；
3）发酵液的预处理，首先要过滤除去菌体等发酵液中不能溶解的杂质，如果产生色素的话最后先去除色素，以免干扰后面的分离过程；同时要根据活性成分成分的性质对活性成分进行一定的浓缩处理，再根据你要用的柱子来进行必要的处理，比如透析出盐等，同时要注意在预处理的过程中尽量保持活性成分的活性。

离心去菌体后，你可以先用各种有机溶剂如甲醇、氯仿等进行萃取，检查萃取液与沉淀物质的活性，确定你的活性成分的大致性质；也可以先用盐析的方法，用硫酸氨等进行盐析，测试活性。这些工作完了以后，可以过开放柱进行初步的纯化，收集活性物组分。有必要的话，上低压色谱柱或是高压色谱。收集活性峰，一般经过高效液相色谱后，就比较纯了。
如果活性物质极性很强，那你就需要换一根可以分离极性物质的柱子，好像C18或是凝胶柱。

发酵液的预处理和固液分离
根据活性物质的许可范围，可以采取酸化、加热、过滤、絮凝、离心等。

提取(分离浓缩)
经常采用的方法有化学萃取、树脂吸附、沉淀等。

精制(纯化)
常采用的方法有结晶、脱色、色谱层析等。
此外在提取步骤中应用的沉淀、吸附等方法也可用于样品的纯化。

提取方法的选择
1.产品的基本理化性能，如化学结构、化合物的溶解度、极性、pK值、官能团反映等。
2.化合物的稳定性，如耐受的pH范围、耐受的温度条件、光照、氧化等。
此外，在分离纯化过程中值得提及的是，尽可能地避免二次污染。如分离纯化过程中使用的水要求去离子，有机溶剂要求高纯级，使用的树脂应该经过预处理除去其中残留的杂质等。

Hplc纯化时可试试调节pH值，适当降低乙腈或甲醇的量

Ⅶ 抗原浓缩的名词解释是什么 急急急

抗原的浓缩
浓缩是低浓度溶液通过除去溶剂(包括水)变为高浓度溶液的过程，在制备生物大分子及各种生化产品时，常在提取后和结晶前进行浓缩，有时也贯穿在整个制备过程中。沉淀(包括盐析和有机溶剂沉淀)，广义上来说也是一种浓缩方法，经过沉淀再溶解，浓度可大大提高，但有时提取液很稀，体积又很大或结晶前除去少量溶剂，则常用其他方法浓缩。
1．蒸发法液体在任何温度下都在蒸发，蒸发是溶液表面的溶剂分子获得动能脱离液面逸向空间的过程。当溶液受热，液体中溶剂分子动能增加，蒸发过程加快。蒸发的快慢和温度、蒸发面积、液体表面积、液面蒸汽分子密度，即蒸汽压大小有关。各种液体在一定温度下都具有一定饱和蒸气压，当液面上的溶剂蒸气分子密度很小，经常处于不饱和的低压状态，液相与气相的溶剂分子为了维持其分子密度的动态平衡状态，溶液中的溶剂分子就必须不断地气化逸出空间，以维持其一定的饱和蒸气压力。因此，根据上述原理，蒸气浓缩装置常按照加热、扩大液体表面积、低压和加速空气流动等因素而设计的。
2．冰冻法冰冻法也是生物大分子及其他有机化合物浓缩的一种有效方法。生物大分子在冰冻时，水分结成冻，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液，用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
吸收法 是一种通过吸收剂直接吸收溶液中的溶剂分子使溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不起吸附作用，易与溶液分开，吸收剂除去溶剂后能重复使用。实验室中最常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝胶等。使用凝胶时，首先选择凝胶粒度大小恰好溶剂及低分子物质能渗入凝胶内，而生物大分子却完全排除于凝胶之外的，然后将洗净和干燥的凝胶直接投入待浓缩的稀溶液中，凝胶亲水性强，在水中溶胀时，溶剂及小分子被吸收到凝胶内，生物大分子留下剩余的溶液中，离心或过滤除去凝胶颗粒，即得已浓缩的生物大分子溶液。凝胶溶胀时吸收水分及小分子物质可同时起到浓缩及分离纯化两种作用，对生物大分子结构和生物活性都没有影响。是近年来生物化学及分子生物学日益广泛使用的浓缩和分离方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收剂时，需先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，扎紧袋口，外加聚乙二醇复盖，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶剂饱和后，可更换新的，直到浓缩至所需的浓度为止。用完一次以后的聚乙二醇经过加热除去溶剂便可再次使用。
4．超滤法超滤法是使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。当溶液在一定压力下(外源氮气压或真空泵压)通过膜时，溶液和小分子透过，大分子受阻保留于原来溶液中，其原理如图2—2所示。这一近年发展起来的新方法是适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持生物大分子生理活性、回收率高等优点。除去浓缩、脱盐外，并可应用生物大分子的分离纯化，是目前民展较快且为人们所采用的生化技术之一。
图2-2超滤法示意图
通过超滤法，蛋白质和酶的稀溶液一般可浓缩到10%～15%浓度，回收率高达90%。超滤法应用关键在于膜选择。不同类型的规格的膜、水的流速(在规定压力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量数值)等参数均不同，必须根据工作的需要来选用。此外，超滤装置形式、溶质成分及性质、溶液浓度及粘度都对超滤的效果有一定影响。
制品浓缩到一定程度，即可贮存，如有必要可采用低温干燥(冰干)的方法除去制品中溶剂，使之成干粉。
制品的贮存可分干态贮存和液状贮存。但不论是何种方法贮存，都要避免长期暴露在空气中，防止微生物的污染。温度对生物活性物质的活性影响很大，在绝大多数情况下应采取低温保存。
干态储藏：干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，在低温情况下，生物大分子活性可在数个月甚至数年没有显着变化。储藏方法也很简单，只将干燥后的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，保持0～4℃冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，可先将样品分装成许多小瓶中，每次用时，只取一小瓶。
液态储藏：液态储藏的优点是使样品减去干燥这一步骤，生物大分子的生理活性和结构破坏较少，缺点是需要较严格的防腐措施，储藏时间不能太长。如样品量大时封装运输不方便，实验室常采取少量安瓿封存方法。液态储藏注意事项如下：
样品不能太稀，必须浓缩至一定浓度后才能封装储藏，样品太稀时容易引起生物大分子变性作用。
一般需加入防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和酶常用的稳定剂有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和辅酶以提高其稳定性，此外钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也具有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸与氯化钠的标准缓冲液中。