制造小白鼠疼痛模型有哪些方法

‘壹’ 怎样构建小鼠模型

6月10日，在钟南山院士指导下，广州医科大学附属第一医院/呼吸疾病国家重点实验室赵金存教授团队与另外四家中美科研团队合作，在国际顶级学术期刊《细胞》杂志在线发表了题为“可广泛应用于新冠肺炎发病机制研究、疫苗研发和治疗方法评价的动物模型建立”的研究成果，应用表达新冠病毒受体人ACE2的腺病毒转导小鼠，快速建立首个新冠肺炎非转基因小鼠模型，该项目负责人赵金存教授在接受总台央广记者独家采访时表示，此动物模型可应用于新冠治疗药物效果评价、疫苗效果测试及新冠致病机制等多方面研究。
赵金存教授在实验室
参与该项研究的另外四家中美科研机构为：广州海关技术中心国家生物安全检测重点实验室(P3实验室)、美国爱荷华大学、广州再生医学与健康广东省实验室、中国科学院广州生物医药与健康研究院。
据了解，新型冠状病毒SARS-CoV-2入侵受体为 human angiotensin-converting enzyme 2(hACE2)，而小鼠同源受体mouse ACE2由于氨基酸关键位点差异，不能介导病毒入侵。疫情早期，虽然我国毒株已分离，但由于国际和国内hACE2转基因小鼠保有量有限，繁育耗时长，临床症状不典型，造成我国COVID-19肺炎诊疗方案、药物、疫苗和致病机制体内验证严重滞后。
在这项研究中，研究团队利用腺病毒载体，在小鼠肺脏转导表达hACE2，成功解决上述科学难题，建立国际首个非转基因新冠肺炎小鼠动物模型。小鼠在SARS-CoV-2感染后，肺脏中可检测到高滴度新冠病毒，每克组织中病毒滴度可达10^7 PFU，并出现体重下降和类似新冠肺炎病人的临床病理表现。
动物模型模式图
随后，通过对比野生型小鼠与I型干扰素受体缺陷小鼠和干扰素通路关键基因STAT1敲除小鼠在新型冠状病毒感染后的差异，发现I型干扰素在新冠病毒感染中起到保护作用。此外，在此模型中，新冠病毒感染可诱导机体产生强烈的病毒特异性T细胞应答及体液免疫应答。更为重要的是该研究团队利用此小鼠模型评价了新冠感染康复者血浆和瑞德西韦对新冠病毒感染的治疗作用。结果显示，给予血浆治疗和药物组的小鼠肺脏病毒滴度均明显降低，且病理损伤减轻。
过继转移新冠康复者血浆和瑞德西韦治疗组，小鼠肺脏病毒滴度下降、肺脏病理损伤减轻。
本模型相比传统受体转基因小鼠模型，构建周期短(2-3周)，不需要特殊繁育，可用于多种基因修饰小鼠动物模型构建;且技术方法简单，易于重复，适宜大规模推广，有利于我国抗病毒药物、抗体、疫苗的应急验证及致病机制研究，并已给我国多家单位广泛共享，有效缓解了我国COVID-19肺炎动物模型缺乏的难题。
值得一提的是，来自华盛顿大学医学院等单位的研究人员同样在Cell杂志背靠背发表了类似的研究成果。
（据央广网）

‘贰’ 求助：如何建立小鼠免疫抑制模型

• 免疫抑制动物模型的制备（三个制模方法选其一即可，造模后进入第二步实验检测造模是否成功。）
  动物的选取：成年C57BL雄性小鼠，或成年BALB/c雄性小鼠。无论选取哪一类小鼠，都要控制鼠龄、性别和体重，以减少个体差异。
  实验动物的分组：分为实验组、对照组、阳性对照组、阴性对照组、假手术组五组。
  1.由免疫抑制剂诱发的免疫功能低下模型
  造模原理：免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关细胞（T细胞和B细胞等巨噬细胞）的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。
  操作方法：
  可以选用下列方法之一诱发免疫功能低下模型：
  1.环磷酰胺 80-100mg/kg 体重，皮下注射，5d。
  2.氢化可的松 50-100mg/kg 体重，每天皮下注射，6~8d。
  3.抗淋巴细胞血清 每只鼠腹腔注射抗淋巴细胞血清0.2ml，5~6d
  造模方法评价：以上三种免疫抑制剂方法均可造出相应的模型，但是他们各有利弊，实验时应该根据具体实验情况选择相应的试剂。制备抗淋巴细胞血清法比较复杂，而且抗体成分可能因为分离不彻底而发生交叉反应，但是此法特异性高，不会对动物造成大的损伤，环磷酰胺和氢化可的松会一定程度上造成动物机体的损伤，在研究中，在同等条件下，分别以常规剂量的氢化考的松（HY）和环磷酰胺（CY）复制免疫抑制动物模型，结果发现：HY模型的各项免疫指标均处于高度抑制状态；CY模型在IL-2的产生水平上处于高度抑制状态，在巨噬细胞吞噬率和血清溶菌酶含量方面呈明显抑制作用，但程度上低于HY模型，然而在巨噬细胞吞噬指数和IL-1产生水平上未呈现明显抑制作用；结果提示：用HY可复制出稳定、典型较为理想的免抑制动物模型。
  2.由辐射诱发的免疫功能低下模型
  操作方法：使用X射线6~8Gy1次照射，4d后可检测。
  造模方法评价：此法制备的动物模型见效快，但是动物存活时间短，对长期实验不利，短期实验使用。
  3.由强电刺激引起的免疫功能低下模型
  条件允许的话，此法应用成年雄性的NIH小鼠。NIH小鼠对应激性疾病的抵抗力较强。
  操作方法：将多用电针仪（电压U=0.2V，电流强度I=4~5μA，连续密波）正电极连接小鼠阴茎根部腹部皮肤，负电极连接阴茎背侧部皮肤，每天刺激两次，每次刺激10Min,连续刺激10d。
  造模方法评价：此法原理是造成小鼠进入应激状态，使其糖皮质激素分泌增加，导致胸腺萎缩免疫功能低下，故造模过程中应该注意预防应激性疾病如胃溃疡、应激性心脏病以及应激性高血压等的发生。

‘叁’ 怎么进行小鼠模型的建立和鉴定

小鼠模型建立方式有很多种，传统的有药物、饮食诱导或手术方式构建，另外也有通过基因编辑的方式来构建，包括基因敲除小鼠、基因敲入小鼠、点突变小鼠、人源化修饰小鼠等等。鉴定方式可以通过qPCR验证、测序或蛋白鉴定等。大大满足了目前的研究需求。

‘肆’ 醋酸致痛小白鼠原理

化学刺激物如醋酸注入小鼠腹腔内会引起深的、大面积而持久的疼痛刺激致使小白鼠产生“扭体”反应。

1、冰醋酸因为是乙酸的结晶物质，会刺激皮肤表面导致皮肤表面出现腐蚀出现感染引起疼痛。

2、因为冰醋酸若是高浓度会在身体内造成高渗环境，很容易引起身体脱水，从而刺激神经引起疼痛。

3、因为冰醋酸还具有破坏皮肤表面的完整性，可直接伤害到皮下的脂肪层，而皮肤脂肪层直接具有很丰富的末梢神经系统，可刺激导致剧烈疼痛。

另外冰醋酸也可以刺激身体脏器，比如心脏的脏层和壁层腹膜可引起较大面积长时间的炎性疼痛。
冰醋酸就是生活中大家所熟知的乙酸，冰醋酸在临床上多数用来治疗皮肤的真菌感染，甚至还可以治疗指甲的真菌感染。因其是乙酸的结晶属于酸性，所以具有很强的腐蚀性，非常容易刺激神经末梢治痛剧烈。

醋酸生物反应：

乙酸中的乙酰基，是生物化学中所有生命的基础。当它与辅酶A结合后，就成为了碳水化合物和脂肪新陈代谢的中心。然而，乙酸在细胞中的浓度是被严格控制在一个很低的范围内，避免使得细胞质的pH发生破坏性的改变。

与其它长链羧酸不同，乙酸并不存在于甘油三酸酯中。但是，人造含乙酸的甘油三酸酯，又叫甘油醋酸酯（甘油三乙酸酯），则是一种重要的食品添加剂，也被用来制造化妆品和局部性药物。

乙酸由一些特定的细菌生产或分泌。值得注意的是醋菌类梭菌属的丙酮丁醇梭杆菌，这个细菌广泛存在于全世界的食物、水和土壤之中。在水果或其他食物腐败时，醋酸也会自然生成。乙酸也是包括人类在内的所有灵长类生物的阴道润滑液的一个组成部分，被当作一个温和的抗菌剂。

‘伍’ 四氯化碳制造小鼠肝炎模型 急

直接腹腔注射就可以啦，可以参考一下：利用5% CCl4按10ml/kg腹腔注射构建小白鼠急性肝损伤模型，然后再用药进行治疗。如果只需染毒，不需要治疗的话，可以在染毒12-18h之后采血，取血清检测酶活性。

‘陆’ 小鼠惊厥模型的制作 关于药理学实验的

一、 惊厥
物理、化学或精神性的刺激所引发的全身骨骼肌不自主的强烈收缩,常见于小儿高热、破伤风、癫痫大发作、子痫和中枢兴奋药中毒等.
二、 惊厥模型的制备
1.物理方法
⑴ 电休克法：以强电流通过角膜电极或耳电极,对动物脑部进行短时间刺激,引起惊厥发作；
⑵ 听觉刺激
⑶ 光刺激
2.化学方法：应用大剂量的化学药物使动物中枢神经系统过度兴奋,常用的药物有硝酸士的宁,戊四唑,印防己毒素和氨基脲等.
三、 常用的抗惊厥药
1.苯二氮卓类：如地西泮
为镇静催眠药,随剂量增大,相继出现抗焦虑、镇静催眠和抗惊厥作用；
2.巴比妥类：如苯巴比妥、异戊巴比妥、硫贲妥
属镇静催眠药,随剂量增大,相继出现镇静、催眠、抗惊厥和麻醉作用；
3.硫酸镁
i.v.具有抗惊厥作用,Mg2+可拮抗Ca2+的作用,抑制神经递质传递和骨骼肌收缩,从而使肌肉松弛,临床常用于妊娠子痫.
本实验所用抗惊厥药为戊巴比妥钠,其用量大于镇静催眠量,故给完药后小鼠可能睡着了.
四、 具体实验
[实验目的]
1.学习制做动物惊厥模型及抗惊厥药的实验方法；
2.观察戊巴比妥钠对士的宁惊厥的保护作用；
3.学习X2检验.
[实验原理]
硝酸士的宁是脊髓抑制性神经元甘氨酸受体的拮抗剂,对脊髓有选择性兴奋作用.皮下注射可致小鼠全身强直性惊厥.戊巴比妥钠促进中枢GABA对GABAA受体的结合,产生超极化抑制性突触效应,从而具有抗惊厥作用.
[实验材料]
1.动物：昆明种小白鼠(18～22g,♀♂兼用)；
2.器材：天平、鼠笼,注射器
3.药品：① 0.5％戊巴比妥钠溶液
② 0.008％硝酸士的宁溶液
③ 生理盐水
[实验方法]
1.每组取小鼠8只,称重,标记,按体重随机分为两组.实验组腹腔注射戊巴比妥钠0.1ml/10g),对照组腹腔注射等容量生理盐水;
2.20分钟后依次给每只鼠皮下注射0.008％硝酸士的宁0.2ml/10g.观察30分钟,记录动物死亡数.
[实验结果]
全班结果汇总,进行X2检验.
[注意事项]
1.剂量要准确,时间掌握好；
2.给药后应保持室内安静,避免刺激实验动物.
质反应资料：将观察单位按属性或类型分组计数所得的资料,如死亡和生存,治愈和未愈,有效和无效等.
本实验结果观察指标为生存、死亡的数目,所以属质反应资料,统计学分析用X2检验.
四格表资料X2检验步骤：
1.建立假设；
2.计算X2值（公式见讲义P18）;
3.查X2表；
4.判断结果.

‘柒’ 小鼠模型都有哪些

小鼠模型有很多种类，包括常规的近交系小鼠C57BL/6J、BALB/c，还有肥胖/糖尿病模型（ob、db）、心血管模型（APOE-/-、LDLR-/-）、免疫检查点人源化小鼠（hPDL1、hTIGIT）、免疫缺陷小鼠（NCG）等等。集萃药康是一家专业从事小鼠模型研发、生产与销售的企业，基于自主构建的基因编辑平台、人源化平台、功能药效平台，可提供各类疾病小鼠模型，同时也可根据您的需求为您精心定制合适的小鼠模型，可以在网络找他们的官网咨询了解！！

‘捌’ 我想建立小鼠皮肤感染模型，如何从分离出的菌株中选出致病力强的菌株

方法很多，我讲一个常规的方式：将致病菌株稀释，分离成单个菌株，并培养成菌落，之后检测菌株的致病能力，把致病能力强的保留，并进一步稀释致病力强的菌株成单个菌株，再培养成菌落检测致病能力，最后就能筛选致病能力强的菌株。

‘玖’ 小鼠模型如何构建

小鼠模型可通过TALEN、ZFN、ES同源重组、CRISPR/Cas9等基因编辑技术构建。集萃药康基因编辑平台熟练掌握各类基因编辑手段，可定制不同策略的小鼠模型，大大满足用户实验需求。

‘拾’ 给小鼠腹腔注射冰醋酸使其产生疼痛的机制

苯巴比妥钠具有良好的抗癫痫和抗惊厥作用，故其可以用于惊厥的治疗。而尼可刹米可以提高机体神经中枢的兴奋性，从而造成机体惊厥，故用尼可刹米复制惊厥模型后用苯巴比妥钠进行治疗，从而观察苯巴比妥钠的抗惊厥作用。 方法 分别前后腹腔注射苯巴比妥钠和尼可刹米后，观察惊厥发生的情况从而观察苯巴比妥钠的抗惊厥作用。 结果与分析 用苯巴比妥钠的小鼠惊厥率为0，而没有用的小鼠惊厥率高达100%，死亡率达50%，比较可以发现苯巴比妥钠具有良好的抗惊厥作用。

惊厥是由于中枢神经系统过度兴奋而引起的全身骨骼肌强烈的不随意收缩，出现强直性或者阵挛性抽搐。苯巴比妥钠属于苯巴比妥类药物，具有良好的中枢抑制作用，故具有抗癫痫和抗惊厥作用。本实验观察其抗惊厥作用。尼可刹米是一种呼吸兴奋剂，中毒剂量时可以造成机体惊厥甚至是死亡。由于尼可刹米的作用比较强而且本实验使用的是中毒剂量，故而应先腹腔注射一定量的苯巴比妥钠后，经过一定时间后再腹腔注射一定量的尼可刹米，观察有无惊厥的出现从而确定苯巴比妥钠的抗惊厥作用。

1 实验材料

1）实验动物：小白鼠

2）实验药品：苯巴比妥钠，尼可刹米，生理盐水

3）实验用具：注射器，电子称，小白鼠笼

2 实验步骤

1）每组取四只小鼠，称重，并分别编号为1,2,3,4号。

2）1,2两只小鼠腹腔注射苯巴比妥钠，0.1ml/10g，3,4两只小鼠腹腔注射生理盐水作为对照组，0.1ml/10g。

3）15min后，分别为四只小鼠注射尼可刹米，0.1ml/10g，并记录号时间。

4）观察并记录四只小鼠是否出现惊厥或者死亡。

3 实验结果

经过如上实验可以得到如下结果：表1

表1

对照组/实验组惊对照组惊实验组死对照组死亡组别 实验组/只 只 厥/只 厥/只 亡/只 /只

1 2 2 0 2 0 1 2 2 2 0 2 0 1 3 2 2 0 2 0 1 4 2 2 0 2 0 1 总数 8 8 0 8 0 4 注：实验组为注射苯巴比妥钠的小鼠，对照组为注射生理盐水的小鼠

通过计算百分率可得表2

实验惊厥百分率

0% 表2 对照惊厥百分率 实验死亡率 100% 0% 对照死亡率 50% 4 实验分析

由以上实验结果可以看到，注射苯巴比妥钠的小鼠没有出现惊厥，也没有死亡。而注射生理盐水的小鼠惊厥出现百分率高达100%，

且死亡率达到50%，通过比较两组实验结果，就可以明显的发现，苯巴比妥钠具有良好的抗惊厥作用，它是一种中枢神经系统抑制药，主要通过增强GABA 作用以及减弱谷氨酸作用而实现抗惊厥作用。

二 镇痛实验

摘要 目的 吗啡属于阿片类镇痛药，具有强大的镇痛作用，通过热刺激（热板法）或者化学刺激的方式引起小鼠疼痛，在经过吗啡镇痛后观测其痛阈的改变从而观察吗啡的镇痛作用，从而了解其镇痛效果和机制。 方法 热板法和化学刺激法 结果与分析 吗啡对热刺激或者化学刺激都具有良好的镇痛作用。

吗啡是阿片类镇痛药的代表药，具有良好的镇痛作用，其主要通过激动阿片受体从而产生镇痛作用，是临床常用药，也属于管制药。当给与一定的温度刺激时，小鼠会产生痛觉，小鼠由于脚部的疼痛而发生疼痛反应，从而出现舔后足的现象。出现此现象越快说明疼痛的潜伏期短，也就是痛阈越低。因此，可以通过比较小鼠出现舔足现象的时间来比较痛阈的大小。同理，给与小鼠腹腔化学刺激时，小鼠会出现扭体的现象。

1 实验材料

1) 实验动物：小白鼠

2) 实验药品：吗啡，生理盐水，醋酸

3) 实验器材：注射器，Woolfe 热板，电子称，秒表，鼠笼。 2 实验步骤

2-1 热板法

1）打开热板预热。取小鼠，筛选舔足时间在5s-30s之间 的小鼠，称重，分作两组，每组两只，作标记。

2）选定实验组和对照组，测定每只小鼠的舔足时间，记录。

3）实验组腹腔注射吗啡0.1ml/10g，对照组注射生理盐水0.1ml/10g。

4）给药后分别于15min,30min,45min测小鼠的舔足出现时间，并记录好。

2-2 化学刺激法

1）每组取四只小鼠，随机分作实验组和对照组，称重，做标记。

2）实验组腹腔注射吗啡0.1ml/10g，对照组腹腔注射生理盐水0.1ml/10g。

3）20分钟后，两组小鼠分别腹腔注射醋酸0.1ml/10g，观察小鼠是否出现扭体现象并记录。

3 实验结果

根据以上实验，热板法可得如下表3的结果：

表3

组别

小鼠编

号 第二组 30给药前 15分钟 30分钟 45分钟 给药前 15分钟 分45分钟

钟 第一组

1 2 3 4 1 2 3 4 实验组均值 对照组均值

11 6 14 15

60 42 15

60 57 14

54 41 15 20

13.59 6.5 10.95 6.15

15 22 第三组

给药前 15分钟 30分钟 45分钟 给药前

25 16 18 19

56 60 45 30

60 60 30 20

60 60 28 18

23.41 14.18 57.76 40.58

43.

34.41 24 21.17 15.8 23 11.01

13.

13.44 57 9.18

10.

6.96 62 12.5 第四组

30

15分钟 分45分钟

钟 31.

25.61 22 20.04 31.17 60 56.76

27.

16.96 78 17.98 60 60 60

13.02 44.70 50.54 41.20 13.85 20.90 18.37 17.11

说明：1 表格中单位为秒。 2 由于第四组小鼠未经过筛选，故而舍去。

由此作出时-效曲线为图1所示：

镇痛与抗惊厥实验报告

而化学刺激法所得结果如下表4所示

组别 1 2 3 4 总数 实验组扭体百

分率 对照组扭体百

分率

实验组/只

2 2 2 2 8 0 100%

表4

实验组扭体/

对照组/只

只

2 0 2 0 2 0 2 0 8 0

对照组扭体/

只 2 2 2 2 8

4 分析

1）从表3及图1 可以看出，用药前实验组和对照组的痛阈几乎一样，而用药后，实验组的痛阈明显高于对照组，这说明吗啡能提高机体的痛阈值，从而具有良好的镇痛作用。

2）图1表明，在经过一段时间的代谢后，机体内的吗啡含量降低，从而痛阈值也跟着下降。

3）同样，表4中显示，注射吗啡后，扭体实验为全阴性而对照组为全阳性，同样说明了吗啡具有良好的镇痛作用。