1. 高效液相色谱分析法的类型
在吸附色谱中,样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上,非极性烃基几乎不予保留。所以,要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常,样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的,强离子样品是不适宜的。
吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础,按照样品的极性加上乙醇,然而,最好是使所加入醇的浓度为10%或更少一些。如有可能,可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性,减弱吸附能力,并使重现困难。 1.正相分配色谱
正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品,但正相分配色谱不适合于离子型物质。
2.反相分配色谱
这种方法应用非常广泛,应用的范围也很广,在反相分配色谱中,样品的非极性部分起保留作用。
通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈,通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离,但如果样品带有离子型基团,需要在流动相中加入盐或调节流动相的PH值,例如,如果样品有一个—COOH 基团,使流动相的PH值是偏向酸性的,由于抑制了—COOH基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法,如果样品有强离子基,有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。
在调节PH值中,保持PH值在填料说明书手册中所规定的范围内,大多数化学键式的二氧化硅使用在PH=2-9,然而,当加入盐以后,最好使其PH=7.5-8或更小的,多孔聚合物填料能应用非常广泛的PH值。 这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的,按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。
离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中,流动相的盐的浓度、PH及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器,在高效液相色谱中不能使用NaCl或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用,例如,醋酸吸收大约在210nm,当检测处在短波端的时候,用醋酸作流动相是不合适的。 凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。
因为在样品中,小尺寸的分子深深地渗透到微孔中,所以迟流出,而大尺寸的分子没有渗透到微孔中,就很快流出。通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相,叫做凝胶渗透色谱。
凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。
1.凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography),简称GPC。此一类的色谱,使用于有机性溶媒的样品中,如PVC,PS,ABS等等,而所用的洗脱液有THF,Chloroform等等。
2.凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱(GelFiltrarionChromatography),简称GFC。此一种类的层析法,使用于水溶媒的试剂中,如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等,而所用的溶液有水、缓冲液等等。
凝胶的种类很多,按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。
2. 高效液相色谱常用什么色谱法
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1.液固色谱法 使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
2.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。
反相色谱法 一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8),太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高~中 中~低
流动相极性 低~中 中~高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线(如氨基键合固定相)。
3.离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架,在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度,进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大,则离子强度高,不利于样品的解离,导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.离子对色谱法 又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂,在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5.排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长;大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
色谱法的基本原理
利用样品混合物中各组分理、化性质的差异,各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中。当两相相对运动时,各组分在两相中反复多次重新分配,结果使混合物得到分离。
两相中,固定不动的一相称固定相;移动的一相称流动相。
分类:
根据流动相分—以气体作流动相—气相色谱——固定相为液体 气-液色谱
固定相为固体 气-固色谱
—以液体作流动相—液相色谱——固定相为液体 液-液色谱
固定相为固体 液-固色谱
—当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱
根据固定相的附着方式
—固定相装在圆柱管中—柱色谱
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱(平板色谱)
—液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
根据分离机理
—分配色谱—样品组分的分配系数不同
—吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸附力不同
—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同,把样品组分按分子大小分开
—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同
根据极性
—流动相极性>固定相极性-反相色谱
—流动相极性<固定相极性-正相色谱
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物,而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质,如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以,HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。
一、吸附色谱(adsorption chromatography)
又叫液固色谱法:流动相是液体,固定相是固体。
分离原理:固定相是固体吸附剂,吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心。样品组分与流动相竞争吸附中 心。各组分的吸附能力不同,使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离。
固定相: 固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。
流动相: 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物,如正构烷烃(己烷、戊烷、庚烷等)、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用: 对于极性,结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法,如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的 分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。
二、分配色谱
原理: 固定液机械的吸附在惰性载体上,样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同,分别进入两相分配而实现分离。
固定相:将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。
根据极性不同分类:正相分配色谱—固定相载体上涂布的是极性固定液;
流动相是非极性溶剂;
可分立极性较强的水溶性样品;
弱极性组分先洗脱出来。
反相分配色谱—固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液;
流动相是极性溶剂;
强极性组分先洗脱出来。
液-液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动相中去,所以重现性很差,且不能进行梯度洗脱,已经不大为人们所采用。
三、键合相色谱
考虑分配色谱法中固定液的缺点,因此将各种不同的有机关能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上,固定相就不会溶解到流动相中去了。
键合固定相优点:○ 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性
○使色谱柱的柱效高、寿命长
○实验重现性好
○几乎适于各种类相的有机化合物的分离,尤其是k’宽范围的样品
○可以梯度洗脱
根据极性不同分类:正相键合相色谱—固定相极性>流动相极性
固定相:二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
适于分离脂荣、水溶性的极性、强极性化合物
反相键合相色谱—固定相极性<流动相极性
固定相:烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表,其极性很小。
适于分离非机性、弱极性离子型样品,
是当今液相色谱的最主要分离模式。
正相HPLC(normal phase HPLC):
是由极性固定相和非极性(或弱极性)流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等,代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。
反相HPLC(reversed phase HPLC):
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系,与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱,Octa Decyltrichloro Silane),代表性的流动相是甲醇和乙腈。
四、体积排阻色谱(SEC,size exclusion chromatograghy)
(又称凝胶色谱和分子筛色谱)
原理: 以多孔凝胶(如葡萄糖,琼脂糖,硅胶,聚丙烯酰胺等)作固定相,依据样品分子量大小达到分离目 的。大分子不进入凝胶孔洞,沿多孔凝胶胶粒间隙流出,先被洗脱;小分子进入大部分凝胶孔洞, 在柱中被强滞留,后被洗脱。
根据样品性质分类:凝胶过滤(GFC)—用于分析水溶性样品,如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝胶渗透(GPC)—用于分析脂溶性样品,如测定高聚物的分子量。
SEC主要依据分子量大小进行分离,因此与样品、流动相间的相互作用无关。因此不采用改变流动相的组成来改善分离度。
五、离子交换色谱
(ion exchange chromatography, IEC)
分离原理:使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团(如磺酸基和羧酸基)可以用于阳离子的分离;带正电荷的交换基团(如季胺盐)可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同,在树脂中的保留时间长短不同,从而被相互分离
3. 高效液相色谱的原理及分析方法
原理主要有这几种:
液—液分配色谱法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同,避免固定液流失),有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。达到平衡时,服从于高效液相色谱计算公式: 高效液相色谱计算公式
式中,cs—溶质在固定相中浓度;cm--溶质在流动相中的浓度; Vs—固定相的体积;Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处,即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大;但也有不同之处,GPC中,流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液 — 液分配色谱法的缺点:尽管流动相与固定相的极性要求完全不同,但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力,会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后),可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。
液—固色谱法
流动相为液体,固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时,所有的吸附剂活性中心吸附的是S),可表示如下:Xm nSa ====== Xa nSm 式中:Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。 当吸附竞争反应达平衡时: K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中:K为吸附平衡常数。[讨论:K越大,保留值越大。]
离子交换色谱法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流 离子交换色谱柱
动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以阴离子交换剂为例,其交换过程可表示如下: X-(溶剂中) (树脂-R4N Cl-)=== (树脂-R4N X-) Cl- (溶剂中) 当交换达平衡时: KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系数为: DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [讨论:DX与保留值的关系] 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
离子对色谱法
(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。其原 离子色谱仪流程示意
理可用下式表示:X 水相 Y-水相 === X Y-有机相 式中:X 水相--流动相中待分离的有机离子(也可是阳离子);Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对(如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等);X Y---形成的离子对化合物。 当达平衡时: KXY = [X Y-]有机相/[ X ]水相[Y-]水相 根据定义,分配系数为: DX= [X Y-]有机相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [讨论:DX与保留值的关系] 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题,诸如酸、碱和离子、非离子混合物,特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
离子色谱法
(Ion Chromatography) 用离子交换树脂为固定相,电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器,为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰,设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。 以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相,分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时,发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的逆过程): 担体图示
抑制柱上发生的反应: R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可见,通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水,消除了本底电导的影响;试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H Br-,可用电导法灵敏的检测。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
空间排阻色谱法
(Steric Exclusion Chromatography) 空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用,但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。
分析方法:
综述
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用;离子交换填料,用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外,柱温为室温,检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进化学键合固定相反应
样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变, 以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求;或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子.
色谱柱的理论板数
在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图化学键合固定相应用
,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2),按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。
分离度
定量分析时,为便于准确测量,要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度(R)的计算公式为: 2[t(R2)-t(R1)] ,R= -W1+W2 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间; t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间; W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外,分离度应大于1.5。
拖尾因子
为保证测量精度,特别当采用峰高法测量时,应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定,或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为: W(0.05h) T=-2d1 式中 W(0.05h)为0.05峰高处的峰宽; d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外,T应在0.95~1.05间。 也可按各品种校正因子测定项下,配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成三种不同浓度的溶液,分别注样3次,计算平均校正因子,其相对标准偏差应不大于2.0%。
4. 高效液相色谱法的原理是什么
高效液相色谱法的原理是以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测。
高效液相色谱法有“四高一广”的特点:
①高压:流动相为液体,流经色谱柱时,受到的阻力较大,为了能迅速通过色谱柱,必须对载液加高压。
②高速:分析速度快、载液流速快,较经典液体色谱法速度快得多,通常分析一个样品在15~30分钟,有些样品甚至在5分钟内即可完成,一般小于1小时。
③高效:分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果,比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
④高灵敏度:紫外检测器可达0.01ng,进样量在μL数量级。
⑤应用范围广:百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析,特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析,显示出优势。
(4)高效液相色谱中的色谱方法有哪些扩展阅读
高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点,但也有缺点,与气相色谱相比各有所长,相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间,除了柱子以外的任何死空间(进样器、柱接头、连接管和检测池等)中,如果流动相的流型有变化,被分离物质的任何扩散和滞留都会显着地导致色谱峰的加宽,柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
空间排阻色谱法以凝胶(gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用,但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。
溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。
在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。
5. 高效液相色谱常用什么色谱法
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法.1.液固色谱法 使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分...
6. 第二十章:高效液相色谱法
与经典色谱比较优点:
与气相色谱比较:
按固定相聚集状态:液液色谱法、液固色谱法
按分离机制:分配、吸附、离子交换、分子排阻四类基本机制
其他分离机制:亲和色谱法、手性色谱法、胶束色谱法、电色谱法、生物色谱法
目前最常用固定相是化学键和相,称为化学键和色谱法
键合相:通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相
正相NP、反相RP
采用氰基、氨基等作为固定相,非极性或弱极性溶剂为流动相。
分离极性至中等极性分子行化合物
分离机制一般认为是分配,也有认为是吸附如形成氢键的
一般规律:剂型强的组分容量因子k大,后出。流动相极性增强洗脱能力增强
十八烷基硅烷、辛烷基硅烷等,有时也用弱极性或中等极性
流动相以水作为基础溶剂再加一定量极性调整剂
分离机制有争论,多种理论模型
影响组分保留行为的主要因素:
分离非极性至中等极性组分
离子对色谱法(IPC)分正相和反相,正相已经少用。
反相离子对色谱法(RP-IPC)是把离子对试剂加入到含水流动相中,使被分析组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电荷的中性离子,使组分k增加,用于分离可离子化或离子型化合物
用于生物碱类、儿茶酚胺类、有机酸类、维生素类、抗生素类药物分析
离子色谱法:将离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法
可以分析无机和有机阴阳离子,氨基酸、糖类、DNA和RNA的降解产物
分为抑制型(双柱型)、非抑制型(单柱型)
对于X - 离子:
双柱型使用两根离子交换柱,一根为分离柱,填有低交换容量的阴离子交换剂,另一根为抑制住,填有高交换容量的阳离子交换剂,两者串联。进入分离柱的组分X - 按正常离子交换色谱分离,在进入抑制柱,除去组分中的OH - 从而使本底电导率降低,利于较大电导率HX的检测。
非抑制型可使用更低交换容量的固定相,浓度很低、电导率很低的流动相,这样本底电导率低,试样离子被洗脱后可直接被电导检测器检测
利用手性固定相(CSP)、手性流动相添加剂(CMPA)分离分析手性化合物的对映异构体的色谱方法。还有间接法(加入手性试剂使一对对映体转变为非对映体用常规方法分离)。
环糊精(CD)也是一种手性选择剂,分离机制主要是由于分子内熟睡空腔的动销和多手性中心的作用,如果对映体能被空腔紧密包络,而且与CD分子外沿的仲醇基作用,则被固定相保留,两对映体与CD作用程度不同从而分离。
亲和色谱法(AC)利用或模拟生物分子之间的专一性作用,从复杂试样中分离和分析能产生转移性亲和作用的物质的一种色谱方法。选择性最高。
要求:颗粒细且均匀、传质快、机械强度高、耐高压,化学稳定性好
液固:全多空硅胶、高庚子多空微球
应用最多的是化学键和相
要求:化学稳定性好;适宜溶解度;与检测器相适应;纯度高;粘度低
使用前经微孔滤膜过滤,除去固体颗粒,还要脱气处理
分离方程式:
选择合适的溶剂强度使组分k在最佳范围内,选择合适种类的溶剂改善选择性使α增大获得良好分离度R>1.5
在化学键和色谱中溶剂洗脱能力即溶剂强度直接与它的极性相关。
溶剂极性用溶剂极性参数表示 ,用以表示正相色谱中洗脱能力
反相键合相色谱溶剂强度用另一强度因子S表示
混合溶剂可以用P或S的加权平均表示
HPLC速率理论方程:
尽可能减小柱外死体积
(349页图)
高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样系统、色谱柱分离系统、检测系统和数据处理系统组成
分类:
要求:灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重复性好、适用范围广
紫外检测器UVD:不破坏样品,只能检测有紫外吸收物质、对流动相有限制
荧光检测器FD:灵敏度更高,只适用于产生荧光物质,体内药物分析常用
电化学检测器ECD:极谱、库仑、安培、电导。电导用于离子检测,安培应用广泛,灵敏度高适用于痕量组分分析,凡是具有氧化还原活性的都能进行检测
蒸发光散射检测器ELSD:适用于挥发性低于流动相的组分,用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、三酰甘油及甾体;对各种物质几乎有相同响应;但是灵敏度低,流动相必须是挥发性不能含有缓冲盐。
仪器自动化:
采集和分析色谱数据:
中心计算机控制系统:
超高效液相色谱法UPLC:借助于HPLC理论及原理,利用小颗粒固定相,非常低的系统体积及快速检测手段等技术,使分离度、分析速度、检测灵敏度及色谱峰容量大大提高,从而全面提升了液相色谱的分离分析效能。
操作条件比较(355表)
优点:分析速度快;分离效能高;灵敏度高——小颗粒技术和整体化仪器设计
van Deemter方程,可以发现固定相粒度越小,分离度越大。同时粒度越小,最佳流动相线速度越大,并有更宽优化范围,因此降低粒度可以提高分析速度。但是会增加系统柱压差,受到固定相机械强度和色谱仪系统耐压性限制
常用外标和内标,少用归一化。对药品中杂质含量测定常用主成分自身对照法
主成分对照法分为不加校正因子和加校正因子两种:
注意进行色谱系统适用性试验:理论塔板数、分离度、拖尾因子和重复性
7. 高效液相色谱的使用方法
高效液相色谱仪操作步骤如下:
1).
过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜.
2).
对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3).
打开hplc工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。
4).
进入hplc控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。
5).
有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。
6).
调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。
7).
设计走样方法。
8).
进样和进样后操作。
9).
关机时,先关计算机,再关液相色谱。
10).
填写登记本,由负责人签字。
11).
流动相均需色谱纯度,水用20m的去离子水。
12).
柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。
13).
所有过柱子的液体均需严格的过滤。
14).
压力不能太大,最好不要超过2000
psi。
高效液相色谱法(HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。它是在生化和分析化学中常用的柱层析仪。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。
该方法有效方便快捷地解决化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中得出想要的数据,成为重要的分离分析技术。
8. 高效液相色谱法的主要类型有哪些
高效液相色谱法分为:液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1、液-固色谱法(液-固吸附色谱法)
固定相是固体吸附剂,它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制
吸附剂:一些多孔的固体颗粒物质,其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后,在随载液流动的过程中,发生如下交换反应:
X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相) 其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为:
K值较小:溶剂分子吸附力很强,被吸附的溶质分子很少,先流出色谱柱。 K值较大:表示该组分分子的吸附能力较强,后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相
常用的液-固色谱吸附剂:薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律:对于固定相而言,非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱,分配比k较小,保留时间较短;但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强,分配比k大,保留时间长。
对流动相的基本要求: 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小
流动相不能影响试样的检测
常用的流动相:甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用
常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不;数量官能团的有机化合物,以及有机化合物的不同的异构体;但液-固色谱法不宜用于分离同系物,因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2、液-液色谱法(液-液分配色谱法)
将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时,在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较快;在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较慢,从而达到分离的目的。
液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同,均服从分配定律:K=C固/C液 K值大的组分,保留时间长,后流出色谱柱。
②正相色谱和反相色谱
正相分配色谱用极性物质作固定相,非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相,极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。
一般地,正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性,而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物,反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。
③液-液色谱法的固定相 常用的固定液为有机液体,如极性的β,β′氧二丙腈(ODPN),非极性的十八烷(ODS)和异二十烷(SQ)等。
缺点:涂渍固定液容易被流动相冲掉。 采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。
使固定浓与担体之间形成化学键,例如在硅胶表面利用硅烷化反应:形成Si-O-Si-C型键,把固定液的分子结合到担体表面上。
优点:
化学键合固定相无液坑,液层薄,传质速度快,无固定液的流失。 固定液上可以结合不同的官能团,改善分离效能。 固定液不会溶于流动相,有利于进行梯度洗提。
④液-液色谱法的应用
液-液色谱法既能分离极性化合物,又能分离非极性化合物,如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同,或化合物的相对分子质量不同,均可以用液-液色谱进行分离。
3、离子交换色谱法
原理:离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换,由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力(作用力)而被分离。
①离子交换色谱法的作用机制
聚合物的分子骨架上连接着活性基团,如:-SO3-,-N(CH3)3+等。为了保持离子交换树脂的电中性,活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X,称为反离子。
②溶剂和固定相
两种类型:多孔性树脂与薄壳型树脂。
多孔性树脂:极小的球型离子交换树脂,能分离复杂样品,进样量较大;缺点是机械强度不高,不能耐受压力。
薄壳型离子交换树脂:在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂,这种树脂柱效高,当流动相成分发生变化时,不会膨胀或压缩;缺点是但柱子容量小,进样量不宜太多。
③离子交换色谱法的应用
主要用来分离离子或可离解的化合物,凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。
广泛地应用于:无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。 4.凝肤色谱法(空间排阻色谱法)
凝胶是一种多孔性的高分子聚合体,表面布满孔隙,能被流动相浸润,吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。
①凝胶色谱法的作用机制
体积大于凝胶孔隙的分子,由于不能进入孔隙而被排阻,直接从表面流过,先流出色谱柱;小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻,然后又从孔隙中出来随载液流动,后流出色谱柱;中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中,但受到较小孔隙的排阻,介乎上述两种情况之间。
凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。
②凝胶色谱法的固定相
软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。
③凝胶色谱法的应用特点
保留时间是分子尺寸的函数,适宜于分离相对分子质量大的化合物,相对分子质量在400~8×105的任何类型的化合物。
保留时间短,色谱峰窄,容易检测。
固定相与溶质分子间的作用力极弱,趁于零,柱的寿命长。
不能分辨分子大小相近的化合物,分子量相差需在10%以上时才能得到分离。
9. 高效液相色谱有几种定量方法其中那种是比较精确的定量方法并简述
峰面积法、峰高法、归一法、外标法。峰面积法是比较精确的定量方法