肠球菌菌种保藏的方法有哪些

‘壹’ 大肠菌群的保存方法

一．菌种的保存
重组 DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组 DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌
1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的
改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点
i.
甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌.
ii.
使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
二、菌种的复苏
复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或 0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。
切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。
三、大肠杆菌培养
1.培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。
1）LB（Luria-Bertain)液体培养基配制
精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%
酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%
氯化钠1.0%
搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基）调pH至7.0，如用进口试剂可不
必调， 高压灭菌20min(120℃ 0.1Mpa)
2）含琼脂的固体培养基配制
（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加 1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入 1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板
（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素或其他必加成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。 (抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度 50μl/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放 2-3天，或37℃放半小时，然后4℃保存备用。
（3）LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50μl/ml；氯霉素-20μl/ml；庆大霉素-15μl/ml；卡那霉素-30μl/ml；春日霉素-1000μl/ml；壮观霉素-100μl/ml；链霉素-30μl/ml；四环素-12μl/ml。
注意：除了四环素保存-20℃，其余均应保存4℃，所有抗生素均应溶于无菌去离子水。四环素对光敏感
2.液体细菌培养
1）小量培养:
(1) 取灭菌 16 或 18mm 口径培养管，加 3-5mlLB 培养基，再加 50mg/ml 氨苄青霉素 3-5ul（宿主菌不加抗生素）
(2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液 5-10ul，转入培养液中，封好管口
(3) 37℃摇床培养 100-200r/min 至生长饱和，约 6-12 小时
2）大量培养:取 500ml 培养瓶内装培养基 100-200ml，及相应抗生素。以 0.5-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。
3.固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。
方法：采用划痕接种法。用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。

‘贰’ 菌种保藏的原理，菌种保藏方法

1、菌种保藏的原理：菌种保藏有多种方法，其原理大多大同小异，主要是人为创造条件尽量降低生物体内的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的，其中低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素。2、菌种保藏方法：菌种保藏常用的方法有冻干保藏法、液氮保藏法、甘油管冷冻保藏法、传代培养保藏法、寄主保藏法、载体保藏法等。

一、菌种保藏的原理

1、菌种保藏的原理是根据菌种的生理生化特性，人为创造条件尽量降低生物体内的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的。在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

2、低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，因此菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。其中低温可减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的，同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制。

二、菌种保藏方法

常用的方法有冻干保藏法、液氮保藏法、甘油管冷冻保藏法、传代培养保藏法、寄主保藏法、载体保藏法等。

1、冻干保藏法

冻干保藏法是最有效的方法之一，具体为：先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。

2、液氮保藏法

液氮保藏法，又称为超低温保藏法，主要利用微生物在低于-130°C的低温下新陈代谢趋于停止的原理，在液氮中（-196°C的超低温下）有效地进行菌种保藏的方法。该方法一般可保藏15年以上，是公认的菌种长期保藏技术之一。

3、甘油管冷冻保藏法

甘油管冷冻保藏法，利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。该方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。

4、传代培养保藏法

传代培养保藏法，又称定期移植保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等，是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待菌种生长完全后，通常置于4℃-6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

5、寄主保藏法

寄主保藏法相当于一般微生物的传代培养保藏法，必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，尚不能用于在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等。

6、载体保藏法

载体保藏法，将微生物吸附在适当的载体如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

‘叁’ 菌种保藏的方法 菌种保藏的方法有哪些

1、沙土保藏法。取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。倒去酸水，用自来水冲洗至中性。烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

2、滤纸保藏法。将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05 kg/cm，121℃灭菌30分钟。将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

3、寄主保藏法。寄主保藏法用于尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，其中最常见的是甘油管冷冻保藏法。

4、甘油管保存法。甘油管冷冻保藏法是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液。取1ml灭菌甘油放入与菌液充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。-20℃保存时间较短。或采用体积比为8：2的甘油-生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。该方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。甘油-生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

5、冷冻干燥保藏法。先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。真空冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。

‘肆’ 菌种保藏的目的，菌种保藏的方法有哪些

1、目的：尽可能的保持菌种的原有性状以及活力的稳定，保证菌种不死亡、不发生变异、不被外物污染，保持菌株的优良性状不发生退化以及优良菌株的存活。2、原理：通过降低微生物体内的代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种的生命，减少变异，常用的方法为低温保藏、缺氧保藏、干燥保藏。

一、菌种保藏的目的

1、目的

在使用和传代的过程中，菌种容易出现污染，发生变异，死亡等情况，从而导致菌种衰退，优良菌种丢失。而菌种保藏的目的就是为了尽可能的保持菌种的原有性状以及活力的稳定，保证菌种不死亡、不发生变异、不会被外物污染，保持菌株的优良性状不发生退化以及优良菌株的存活。

2、原理

菌种保藏的原理是通过降低微生物体内的代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种的生命，减少变异。常用的方法主要为低温保藏，缺氧保藏，干燥保藏。除此之外，避光，添加保护剂，缺乏营养等也可以提高保藏的效果。

二、菌种保藏的方法有哪些

1、斜面低温保藏法

将菌种接种到适合的固体斜面培养基上，等到菌种充分生长过后，使用油纸将棉塞部分包扎好，然后转移至2-8℃的冰箱中进行保存。

2、液体石蜡保藏法

（1）使用三角烧瓶将液体石蜡装好，塞上棉塞，并用牛皮纸进行包扎，0.1MPa，121.3℃灭菌30分钟左右，然后转移至40℃的温箱中，将水汽蒸发掉。

（2）将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后使用灭菌吸管将石蜡注入斜面上，用量为高出斜面顶端1cm为宜。

（3）将试管直立，放置在低温或者室温的环境下进行保存。

3、滤纸保藏法

（1）准备好滤纸条（0.5×1.2cm），装入安瓿管中（0.6×8cm），每个管中放入1-2张，然后塞上棉塞，在0.1MPa，121.3℃的环境下灭菌30分钟。

（2）将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后取出1-2ml的灭菌脱脂牛乳，滴加在灭菌培养皿内，接着取数环菌苔在牛乳内混合均匀，制成浓悬液。

（3）使用镊子将滤纸条夹出，浸入菌悬液内，吸饱后，放回安瓿管中，塞上棉塞。

（4）将安瓿管放入装有五氧化二磷的干燥器，并用真空泵抽气至干，然后将棉花塞入管内，用火焰熔封，放置在低温下保存。

（5）当需要使用菌种的时候，将安瓿管口在火焰上烧热，在烧热的部位滴上一滴冷水，使玻璃破裂，再用镊子将瓶口端的玻璃敲掉，等到打开安瓿管后，将滤纸取出，放入液体培养基内，置温箱中培养。

4、沙土保藏法

（1）取出河沙，加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟（除去有机质）。

（2）将酸水倒掉，并用自来水将河沙洗至中性，然后进行烘干，过筛（40目筛子），将粗颗粒去掉。

（3）取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，浸泡洗涤数次，直至为中性。

（4）烘干，碾碎，过筛（100目筛子），去除粗颗粒。

（5）将沙和土按照2：1的比例混合，装入试管中，塞好棉塞，灭菌30分钟左右。

（6）将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后向斜面培养物中注入3-5ml无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。

（7）用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2-0.5ml，然后真空抽去管中的水分。如果是放线菌和霉菌可以直接挑取孢子拌入沙土管之中。

（8）将沙土管用火焰熔封，然后放置在低温（4-6℃）干燥处保藏，或者是将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。保存过程中，需要每隔半年检查一次菌种的存活性和纯度。

5、甘油管保存法

（1）将80%的甘油进行高压蒸汽灭菌。

（2）将菌种放置在斜面培养基上培养，然后使用无菌水制成高浓度的菌悬液。

（3）使用1ml的甘油与菌液混合均匀，让甘油的浓度为10-30%左右，然后将其放置在零下70℃的环境下进行冻存。

（4）也可以使用甘油-生理盐水（体积比8：2），和菌体肉汤混合均匀，然后放置在零下20℃的环境下进行保存。

6、冷冻干燥保藏法

（1）在低温下将细胞快速冻结，然后在真空条件下进行干燥，同时为了保证细胞在冷冻和水分升华的过程中不受损害，应当使用保护剂来制备细胞细胞悬液（菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质），通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。

（2）干燥后的菌种在真空下封装，和空气隔绝，从而实现长期保藏。

（3）该方法兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除开丝状真菌的菌丝体外，其它各类微生物大多都适用。

‘伍’ 菌种保存 长期保存菌种的方法

1、液体石蜡保存法。液体石蜡保存法就是在斜面菌种或穿刺菌种表面覆盖一层液体石蜡，从而隔绝空气，减少菌种及培养物水分挥发，保藏温度要求在4℃下即可。将培养好的菌种斜面，缓慢倒入无菌的液体石蜡，使石蜡高出斜面顶端1厘米，直立放置，低温保存就可以，霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年。

2、沙土保存法。沙土保藏法是将菌种吸附在适当的载体上，而后进行干燥的保藏。将培养好的菌种接入沙土管内，用真空泵抽气至干。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。

3、甘油管保存法。甘油管保存是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。配置30%浓度的无菌甘油，将培养好的菌种与甘油充分混合均匀，放入-20℃保存。

4、冷冻干燥保藏法。冷冻干燥保存法就是将菌种与保护剂混合均匀后，快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分，兼具低温、干燥、除氧三方。干燥后的菌种在真空环境下可长期保存。

‘陆’ 菌种保存的方法有哪些，菌种传代操作规程

二、菌种传代操作规程

1、点燃酒精灯，在火焰旁的上方灼烧接种环。

2、将原有的菌种斜面培养基（菌种管）和待接种的新斜面培养基（接种管）用左手的拇指、食指和中指夹住，菌种管在前，接种管在后，然后斜持试管（45°），让试管内斜面向上，两个试管的口子平齐。

3、右手在火焰旁边转动两管的棉塞，然后右手拿着接种环的柄端，垂直将接种环在火焰上灼烧，顶端的环必须烧红，而且凡是接种时进入试管的部分，均应通过火焰灼烧。

4、使用右手的小指和手掌之间以及无名指和小指之间，将两管的棉塞拔出，拿住，然后将试管在火焰上通过。

5、将接种环插入菌种管内，接触无菌苔生长的培养基，待冷后，从斜面上挑取少许菌苔，然后迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种（由下而上划直线，然后由下往上划曲线）。

6、接种完毕后，将管口通过火焰灭菌，并将棉塞塞上。

‘柒’ 菌种的长期保存方法 菌种保藏

1、传代培养保藏法：包括又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等，培养后于4-6℃冰箱内保存。其中斜面培养法是将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。

2、液体石蜡覆盖保藏法：液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4-4℃下，液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

3、载体保藏法：载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4、寄主保藏法：寄主保藏法用于尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

5、甘油管保存法：甘油管冷冻保藏法是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液。取1ml灭菌甘油放入与菌液充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。-20℃保存时间较短。或采用体积比为8：2的甘油-生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。该方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。甘油-生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

6、冷冻干燥保藏法：先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。真空冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。

‘捌’ 常见的保存菌种的方法 常见的保存菌种的方法介绍

1、斜面传代保藏法。此法是把菌种接种到所需要的斜面培养基上，在最适温度下培养，长出丰满的菌体细胞或孢子后，置于4℃冰箱或冷库保藏。此法方法简单，存活率高，适用于各类菌株的保藏。但保藏时间不长，需定期传代，传代过程中易退化污染，只适用于短期保藏。

2、甘油管冷冻保藏法。甘油管保藏法是将富集培养后的菌液与已灭好的甘油充分混合，使终浓度控制在20-30%之间，分装至甘油管中，最后置于-70℃冰箱或液氮罐保藏。此法相比斜面传代保藏时间更长，温度越低，保藏时间越久。

3、液体石蜡保藏法。液体石蜡保藏是在斜面培养或穿刺培养上加一层液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥，隔绝空气，降低菌种细胞代谢速率。此法更适用于细菌和酵母菌。

4、沙土管保藏法。沙土管保藏法是把微生物附着在砂质载体上，目的是为了将微生物赖以生存的水分蒸发掉，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较长保藏的目的。此法适用于霉菌和放线菌。

5、真空冷冻干燥保藏法。该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种有利条件，使微生物的代谢处于相对静止状态。同时该法可用于细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌及病毒的保藏。因而具有保藏菌种范围广、时间长（10-20年）、存活率高等特点，是目前最有效的菌株保藏方法之一。

‘玖’ 保藏菌种的方法有哪些

1、传代培养保藏法：包括又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等，培养后于4-6℃冰箱内保存。

2、液体石蜡覆盖保藏法：液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间。

3、载体保藏法：载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法。

4、寄主保藏法：寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物。

5、冷冻干燥保藏法：先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。

(9)肠球菌菌种保藏的方法有哪些扩展阅读

菌种保藏的原理：

菌种保藏有多种方法，其原理大多大同小异，主要是运用一些方式尽量降低生物体内的代谢，达到延长生命，减少变异的目的。通常采用的方法为低温、缺氧、干燥。

低温主要对菌种产生两方面的影响，首先，较低的温度可以减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的。其次，低温同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制，如果降温过程失误，同样会造成机体的机械损伤和溶质损伤。