❶ 如何分离，提纯白蛋白球蛋白的方法
一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血细胞与血清分离：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞,上部为血清).
2. 乳糜粒分离：4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆,上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮,将乳糜粒吸出,留其余液体备用.
3. 血清蛋白分离：除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白质.
5000rpm 10°C离心1h,密度梯度离心
梯度.液配置：管容量1/3为血清,2/3为1.31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1.21g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白,下部5/6为其它蛋白.
4.取2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9％氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml,加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min,此步骤可重复1～2次
3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白(1)装柱：海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0ml洗脱液.边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内,打开柱底部出口,调节流速0.3ml/min.凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高,床面上保持有洗脱液,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”.用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面,关紧下端出口,用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品,将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面.柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口,将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内.关闭出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁.打开下端出口,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液.如此重复三次,以洗净内壁上的样品溶液.然后可加入适量缓冲液开始洗脱.加样开始应立即收集洗脱液.洗脱时接通蠕动泵,流速为0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml.(3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底),按洗脱液的顺序每管取一滴,分别滴入比色板中,前者加双缩脲2滴,出现蓝色混浊即示有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中,加人奈氏试剂l滴,以观察NH4+出现的情况. 合并球蛋白含量高的各管,混匀.除留少量作电泳鉴定外,其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化.三．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度,并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡,然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上,用同一缓冲液洗脱、分管收集.用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况.(装柱、上样、洗脱,收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析).四．浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低.为便于鉴定,常需浓缩.收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶,摇动2～3min, 3000r／min 离心5min.上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液.五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白(一)仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择用竹夹子取一片薄膜,小心地平放在盛有缓冲液的平皿中,若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点等,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果.将选好的薄膜用竹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后,方可用于电泳.
2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条.在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内.当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上.滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,因而称为滤纸桥.
3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽,使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态,一般需平衡15——20min.注意,取出平衡装置时应将活塞关紧.
(二)点样
1.制备点样模板取一张干净滤纸(10×10cm),在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线,此线为点样标志区.
2.点样用竹夹子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液.无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐.点样区距阴极端1.5cm处.点样时,先用玻璃棒或血色素吸管取2—3��L血清,均匀涂在加样器上,再将点样器轻轻印在点样区内,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线.此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样.
(三).电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上,要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂.如一电泳槽中同时安放几张薄膜,则薄膜之间应相隔几毫米.盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10min.用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接,注意不要接错.在室温下电泳,打开电源开关,用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA).通电10—15min后,将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA),电泳时间约50—80min.电泳后调节旋扭使电流为零,关闭电泳仪切断电源.
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖镊子取出电泳后的薄膜,放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中,浸染5min,取出后再用漂洗液浸洗脱色,每隔10min 换漂洗液一次,连续数次,直至背景蓝色脱尽.取出薄膜放在滤纸上,用吹风机的冷风将薄膜吹干.
(五)透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡,约2—3min薄膜完全透明.若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味.再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平.此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描.长期保存不褪色.
(六)结果判断与定量血清蛋白电泳经蛋白染色后,可显示出区带,未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定.可采用洗脱法或光吸收扫描法,测定各蛋白组分相对百分含
❷ 如何去除血清中的蛋白，急急急
盐析，中性盐使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。eg.硫酸铵
有机溶剂沉淀，极性有机溶剂降低介点常数使蛋白质凝集沉淀。eg.甲醇、乙醇、丙酮。
磺基水杨酸也可以沉淀蛋白质，但要加酸调节ph，使之低于血清蛋白的pi，使蛋白质带正电荷，与水杨酸酸根结合生成不溶盐而沉淀。
血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多。而血清白蛋白等电点为4.7－4.9。所以把ph调到4.7以下就可以了。
❸ 血清蛋白的分离方法
请给出具体条件和题目强调的牛血清蛋白和溶菌酶之间的区别，不给条件的话就说什么都可以用，电子显微镜一个个找，肯定可以，时间问题
❹ 测定血清总蛋白的参考方法是
、总蛋白检测方法:凯氏定氮法
将血清与强酸一起加热消化,使血清中的含氮化合物转化为铵盐,再加碱使铵盐成为氨进经蒸馏分离出来,最后用酸滴定测定氮量,按每克氨相当于6.25g蛋白质计算蛋白质的浓度。
2、总蛋白检测方法:双缩脲法
蛋白质中的肽键(-CONH-)在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色复合物,产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质含量成正比。
3、总蛋白检测方法:酚试剂法
蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物。Lowry改良法在酚试剂中加入Cu2+,提高了呈色的灵敏度,其中75%呈色靠铜离子产生。Lowry改良法的灵敏度为双缩脲法的100倍左右。
总蛋白检测方法
4、总蛋白检测方法:UV法
这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
5、总蛋白检测方法:BCA法
原理 BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿,即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时,蛋白质将Cu2+还原为Cu+,工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
BCA蛋白浓度测定试剂盒,Abbkine的蛋白质定量试剂盒(BCA法)提供一个简单,快捷,兼容去污剂的方法,准确定量总蛋白。
❺ 免疫球蛋白提取实验注意事项及原因
IgG的分离与提纯
（一）材料与试剂配制
1．动物血清
2．硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4•12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．1％BaCl2溶液
5．纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃纸）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。
2．3 000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3．在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min。
4．3 000r/min离心20min，弃上清。
5．于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min。
6． 3 000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。
7． 用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。
8． 透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。
以1％BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+（取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4+存在），直至无 SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9． 离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）。
12．IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。
⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。
⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
⑶ 免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。
⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。
13．IgG的浓缩与保存
⑴ IgG的浓缩：参看本章第九节。
⑵ IgG的保存：一般浓缩至1％以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。
（三）IgG的简易快速提取法
应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。
1． DEAE-纤维素直接提取法
取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。
⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。
⑵用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。
⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。
⑷于4℃中放置1h，中间搅拌数次。
⑸用布氏漏斗抽滤，再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。
2．DEAE－SephadexA－50为弱碱性阴离子交换剂，经NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ－G。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得γ－G无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE－SephadexA－50若干克，悬浮于蒸馏水中，1h后倾去上层小颗粒，然后用0.50Mol/L NaOH处理1h，蒸馏水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液体体积1/4的滤干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不时搅拌、抽滤、收集滤液。
⑶ 再用同样重量的DEAE－SephadexA－50处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为γ－G制品。
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。
❻ 常用的血清蛋白质含量测定方法有哪些
四种血清总蛋白质的测定的方法：
1.基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚试剂比色法 由于各种蛋白质分子中上述两种氨基酸的组成比例不同，特别是白蛋白含色氨酸为0.2%，而γ-球蛋白中含量达2%-3%，导致较大的差异。Lowry的改良法在酚试剂中加入Cu2+，集中原法和双缩脲反应两者的作用，使呈色灵敏度提高。其中75%的呈色依赖于Cu2+.反应产物最佳吸收峰在650-750nm，方法灵敏度为双缩脲方法的100倍左右。有利于检测较微量的蛋白质。但试剂反应仍易受多种化合物的干扰。
2.紫外测定法 采用280nm和215/225紫外吸收值，计算蛋白质含量280nm 是由于蛋白质分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特异性和准确性受蛋白分子中该种氨基酸的含量比例影响甚大。尿酸和肝红素在280nm附近有干扰。紫外区200-225nm是肽健的强吸收峰。在此区域其吸收值为280nm的10-30倍，将血清稀释1000-2000倍可以消除干扰物质的影响。
3.采用沉淀反应进行散射比浊法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚为简便，不需特殊仪器，技术关键在于：①选择最佳试剂浓度及温度；②混匀技术；③选用的标准；④待测标本中的蛋白浓度。
4.染料结合法 蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑（amino black）与考马亮蓝（comassive brilliant blue ）。这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。
❼ 血清γ-球蛋白的测定方法为
正确答案:D
解析：免疫透射比浊法测定血清前清蛋白操作简单，线性范围宽，重复性好，准确性高，适用于全自动分析仪的常规测定
。醋酸纤维薄膜电泳可以测出血清γ-球蛋白
。血清清蛋白的测定方法是溴甲酚绿法
。
❽ 分离提纯蛋白质时常需去盐,常用去盐的方法有哪些
蛋白质沉淀的定义： 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质沉淀的方法： 盐析法 ——多用于各种蛋白质和酶的分离纯化； 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等。针对温度这一条，需要强调：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-四℃进行。 使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H二S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H二S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，一00℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 有机溶剂沉淀法 ——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化； 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：一）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；二）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；三）在生化制备中应用比盐析法广泛。但是，在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此，操作要求在低温下进行。有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和二-甲基-二,四戊二醇等。 等电点沉淀法 ——此法单独应用较少，多与其它方法结合使用； 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调PH吧.0去除碱性蛋白质，再调PH三.0去除酸性蛋白质。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。 重金属盐沉淀法 ——常用于抢救误服重金属盐中毒的病人； 许多有机物质包括蛋白在内，在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间的作用机制，可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类，如铜锌镉；亲羧酸疏含氮化合物类，如钙镁铅；亲硫氢基化合物类，如汞银铅。蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感，调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂），即可沉淀多种蛋白。沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒
❾ 血清r球蛋白提纯实验报告实验结果怎么写
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100 mL血清中约含1.2 g左右。不同种类的蛋白质其分子量、溶解度，以及在一定条件下带电荷的情况有所不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯蛋白质。首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。纯化后的γ-球蛋白可利用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。
❿ 求分离，纯化,鉴定γ球蛋白的具体方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）谢谢
[原理]
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：
用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
[操作]
(1)盐析――中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000r／min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即为粗提的γ－球蛋白溶液。
(2)脱盐――凝胶柱层析
①装柱
洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。
②上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。
加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。
③洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20％磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。
合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。
(3)纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。
(4)浓缩――经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。
(5)鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳 取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十四：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。
[注意事项]
(1)凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。
(2)装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。
(3)本法是利用γ-球蛋白的等电点与α-、β-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。
(4)电泳注意事项见实验二十四。
(5)凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02％叠氮钠。保存于4℃冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60～80℃烘干贮存。
(6)离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。
离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02％叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。
除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。
浓缩γ-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10℃以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 SephadexG一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。
[试剂]
(1)饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
(2)葡聚糖凝胶G一25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G一25干胶 25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90～100℃水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2～3次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。
(3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克加0.5mol／L盐酸溶液15ml，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。
(4)0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)
A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。
B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至 1000mL。
取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混匀后即成。
(5)20%磺基水杨酸溶液
(6)奈氏(Nessler)试剂应用液
①贮存液；称取碘化钾(KI)7.58于250ml三角烧瓶中，用蒸馏水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振摇10min(此时产生高热，须冷却)，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100ml。
②应用液：取贮存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。
(7)0.9％氯化钠溶液
(8)乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂(见实验二十四)
(四)亲和层析
生物体中许多高分子化合物之间具有专—性可逆结合的特征，例如：酶蛋白和辅酶，抗原和抗体，激素与受体，核糖核酸与互补的脱氧核糖核酸等。生物分子间的这种专一性结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和力大小产生吸附和解吸作用而建立的层析方法称为亲和层析。
亲和层析的基本过程如下：具有亲和力的一对分子，其中一种分子作为配基，固定化结合在不溶性载体上装入层析柱成亲和柱，当含有另—种分子的混合液作为流动相流入亲和柱时，能与配基亲和结合的分子被吸附，其它杂质直接流出，再改变流动相的溶液，使配基与其亲和物解离从而解吸出待分离的分子来。
亲和层析中最常用的具有亲和力的生物体系有：
酶：底物、抑制剂、辅酶
抗体：抗原、病毒、细胞
外源凝集素：受体、载体蛋白
细胞：细胞表面特异蛋白，外源性凝集素