转染效率的检测方法有哪些

‘壹’ 如何用流式细胞仪检测转染细胞的效率

1. 阴性对照最好用转染无GFP载体的细胞，因为转染可能会改变细胞的自发荧光本地

2. 确保阴性对照和实验细胞的浓度相同，具体多少倒是无所谓，不要太稀释就好

3. 上机前，用细胞滤网过滤掉大块未消化的杂质

4. 不要固定，GFP固定后荧光强度会下降。
   

‘贰’ 如何鉴定细胞的转染效率

通常是带上一个报告基因，比如绿色荧光蛋白，然后在镜下观察看发光的和不发光的细胞比

‘叁’ 转染效率检测方法

除了直接在荧光显微镜下观察计数，现在很多细胞计数仪也有相应功能，推荐瑞沃德的荧光细胞计数仪，上样之后就能直接查看相应结果。

‘肆’ 如何鉴定细胞的转染效率

IF\ FCM 等方法。

‘伍’ 用那种方法可以提高RAW 264.7细胞转染效率

在6孔板中用Zeta Life Advanced DNA RNA转染试剂高效率转染RAW 264.7细胞方法总结。

实验方案如下：

一、质粒DNA准备

1、质粒DNA浓度700ng/ul（注意：①溶解于无菌双蒸水或超纯水；②无内毒素），

二、操作流程

1、先将细胞接种到6孔板细胞培养板，细胞汇合度在70%左右，再进行转染。

2、复合物制备：将质粒DNA与Zeta Life Advanced DNA RNA AD600150转染试剂按照1:1（12ug:12ul）关系直接混合，用移液器吹吸10-15次混匀，室温静止10-15分钟。

3、将复合物加入完全培养基的细胞培养板，并轻轻混匀，放入培养箱中继续培养（不建议把复合物加入到无血清的培养基里面，后期会进一步摸索此条件）。

4、转染24小时后对细胞进行正常换液。

5、质粒DNA转染48小时后荧光检测转染效率

下图是转染raw 264.7细胞的荧光和明场图片

三、RAW 264.7细胞简述：

RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞. 此细胞株源自雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。 sIg-, Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原阴性。此细胞株不分泌可检测到的病毒颗粒，XC斑点形成试验阴性。 可以胞饮中性红并吞噬乳胶颗粒与酵母聚糖。 可以抗体依赖性地分解绵羊红血球与肿瘤靶细胞。

‘陆’ 是否瞬转成功如何检测

博凌科为解答：可以先使用有荧光蛋白的空载体验证整个系统的转染效率，用流式检测就可以了，非常方便。确定转染效率没有问题后可以转染带有目的基因的质粒。对于转染效果的验证主要取决于你的目的蛋白的性质。主要是mRNA和蛋白水平的验证。mRNA水平可以使用普通PCR或者定量PCR，前者是定性， 后者定量。但是最主要的还是蛋白水平的检测，如果是膜蛋白，那么流式检测最方便，如果是胞外分泌型那么可以用上清做ELISA或者Western都可以， 如果是胞浆分泌型的那么就用Western或者流式都可以。

‘柒’ siRNA实验方法和设计常见问题解答

Q:如何选择转染方法和转染试剂？

A:我们的siRNA适用于各种转染方法。转染方法和转染试剂的选择，需要根据细胞来选择，对于容易转染的细胞，常用的转染方法是脂质体转染。

Q:对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？

A:1)对于贴壁细胞，推荐采用转染试剂转染即可；2)对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。

转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。具体可以参考我们的产品说明书。

Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关？

A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法，而于siRNA的序列并没有直接关系。因此，siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。

Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜？

A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用lipofectamine 2000作为转染试剂，单独转染siRNA，30%～50%密度较佳；而siRNA与质粒共转染，密度可以到80%-90%。

Q:siRNA转染时的培养基要求，可否含血清？

A:不同的转染试剂可能有不同的要求，对于lipofectamine 2000，在配制siRNA和lipofectamine 2000混合物时不能含有血清，但细胞培养基可以含有血清，但不能含有抗生素。

Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别？

A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度，锐博推荐的贮存液浓度为20 μM；而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度，一般10～100 nM范围内，锐博生物推荐的转染浓度是50nM。

Q:转染时该如何分组？分组的目的是什么？

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Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要？

A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说，当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。

Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用？如何选择？

A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA，用于监测实验体系和实验方法的可行性。我们可以提供的阳性对照siRNA有针对GAPDH，ACTB，GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照，客户可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA，主要用于说明siRNA作用的特异性。阴性对照的选择可以是通用的序列（universal）或是随机打乱的序列（scramble），客户可以根据实验要求选择。

Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率？是不是每次实验都必须做？

A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记，可以通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪等荧光检测仪器检测。 除此之外，还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关，同等实验条件下，每次转染细胞转染效率应该是相近的，因此可以不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组，将会更加便于排除一些实验问题。

Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段？

A:FAM在495nm处有最大吸收率，在520nm处有最大发射率。

Cy3在550nm处有最大吸收率，在565nm处有最大发射率。

Cy5在643nm处有最大吸收率，在667nm处有最大发射率。

Q:转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？

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Q:到了转染时间发现细胞密度太低，该如时转染还是让细胞多长一天再转染？

A:细胞生长需要一定的密度，而转染试剂对细胞有一定的毒性，如果转染时细胞密度过低，细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性，一般也不建议用生长几天的细胞做转染。

Q:siRNA的作用效果应该如何检测？

A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果

3）根据目的基因的功能，从细胞表型的水平检测。

Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间？什么时候才是最好的检测时间？

A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象，不能稳定传代，一般其作用时间不可能维持很长时间，通常建议在转染后3 4天内完成检测。最佳检测时间，因细胞、目的基因而异，多在转染后24 48小时之间检测。

Q:为什么要强调mRNA水平检测？可以直接检测蛋白和功能吗？

A:siRNA直接作用于mRNA，因此mRNA水平检测是最直接在指标。

很多客户认为，mRNA的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降，因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上，很多情况下往往出现，mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有：

Q:干扰效率多高才是好的靶点？

A:没有明确的界定，干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同，不同基因的表达水平也相差较大，主要看干扰效果而定。

Q:沉默效果不理想，应该如何处理？

A:最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求，可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。

Q:siRNA反而使得目的基因表达上调了，这是什么原因？该怎么解决？

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Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果，这说明了什么？

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Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样？如果偏差很大该怎么办？

A:正常情况下，各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大，只需考虑实验结果的准确性。另外，对于一些特定的基因，比如与细胞难受压力相关的基因，又如参与细胞免疫的基因，可能会对外界压力比较敏感，使得各组对照的基因表达发生变化不一致。

Q:用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？

A:当干扰效率不佳时，可以在一定范围内适当优化转染浓度，通常优化的范围是10~150nM，但不宜过大，高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。

Q:同样的siRNA，为什么在细胞A很有效，在细胞B则没有效果？

A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样，这些都与siRNA的作用效率有关
siRNA实验方法和设计常见问题解答- 答疑集锦- 非编码RNA研究策略-锐博技术专题专题—丁香园会议频道 (dxy.cn)

‘捌’ 如何用流式细胞术测定细胞转染率

转染成功一般都会表达GFP蛋白,这个蛋白在流式上面可以用FL1通道检测到.转染成功的有表达,不成功的没表达,很容易算出细胞转染率.