内生菌纯化方法有哪些

⑴ 内生菌的纯种分离最适宜用什么方法，操作中还应注意什么（比如仪器，操作环境等） 新手求问啊

内生菌分为内生细菌、真菌、放线菌。三种菌的分离方法各不相同。内生菌分离过程中最重要的是消毒方法的建立，这个要根据你的样品设计，参考一下文献，看一下别人用什么消毒，一般是酒精和次氯酸钠。自己摸索好消毒时间和浓度，因为不同的样品，所要求的消毒时间不同。
消毒方法确立后，再就是培养基的选择，这个你可以参考文献，根据目的不同设计培养基。
纯化过程中最好每天固定时间看一下菌落生长情况，及时再次纯化。

⑵ 分离植物内生菌，可以用什么表面消毒方法

：１）在无菌工作台内，将欲分离内生菌的宿主样品用无菌水清洗；２）选用消毒后的密封容器，使上述清洗后的宿主样品完全浸没于所述密封容器内的无菌水中；３）然后将上述密封容器放入超声波消毒机的水槽内进行消毒，所述超声波消毒机的工作频率为１５～２５ＫＨｚ、功率为５０～２００Ｗ、时间为１０～３０分钟。采用本发明的消毒方法，既能充分消灭宿主表面的杂菌，又能最大限度减少宿主内生菌的损伤。

⑶ 如何纯化菌种

菌种在分离、保藏和生产过程中，极易遭致杂菌污染，因此必须对染有杂菌的菌种进行提纯，方能用于生产。根据污染的类型和程度，需采用不同的纯化措施。
（1）排除细菌或酵母菌污染
在菌种培养中，用肉眼仔细观察培养基表面，不难发现被细菌或酵母菌污染的分离物常出现黏稠状的菌落。取被纯化物接种在无冷凝水、硬度较高（琼脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培养温度至15～20℃，利用某些大型真菌在较低的温度下，菌丝生长速度比细菌蔓延速度快的特点，用尖细的接种针切割菌丝的前端，转接到新的试管斜面培养基中培养，连续2～3次就能获得所要的纯菌丝。也可打破试管，挑取内部长有基内菌丝的琼脂块，移入无冷凝水的培养基上，该法适于被好气性细菌污染的母种。
（2）排除霉菌污染
霉菌和细菌不同，它和食用菌菌丝很相似，也有气生菌丝和基内菌丝。分离的方法主要是抑制杂菌生长，拉大食用菌菌丝生长和杂菌菌丝生长的范围差，从食用菌菌落前端切割，移植入新培养基。杂菌发现越早，分离的成功率越大。严格地说，在斜面培养基上的非接种部位发现的白色菌丝，应认为是杂菌菌落，应马上提纯。若有色孢子已出现，一方面易使分生孢子飘散，另一方面其基内菌丝早已蔓延，可能和食用菌菌丝混生一起。如霉菌刚出现孢子且尚未成熟、变色，则可采用前端菌丝切割法提纯。转管时先将菌丝接种在斜面尖端，当长满斜面后，及时将原接种点连同培养基一起挖掉；如霉菌菌落颜色已深，说明孢子已成熟，稍一振动孢子就会飘满培养基，若再行上法意义不大。如菌丝蔓延范围较大，可将0.2%升汞溶液或1%多菌灵处理过的湿滤纸块覆盖在霉菌的菌落上，可抑制霉菌生长，防止孢子扩散，后用灭菌接种铲将表层铲掉，随之用接种针钩取基内菌丝移入新的培养基，如此2～3次。
（3）限制培养
取直径7～10毫米、高4～6毫米的玻璃环或不锈钢环，经酒精灯火焰灼烧后趁热放到斜面培养基中央，将环的一半嵌入培养基内，然后将染有细菌的接种块放入环内进行培养。细菌生长会被限制在环内，而食用菌菌丝则可越过环而长到环外的培养基上，转管后即可得到纯化。
（4）覆盖培养
在污染了细菌的食用菌菌丝斜面上倾注一层厚约2毫米的培养基，培养一段时间，当食用菌菌丝透过培养基形成新的菌落时，即可切割转管。最好进行二次覆盖。
（5）基质菌丝纯化培养
对棉塞长有霉菌的试管斜面，可将试管打碎，取出培养基，用0.1%升汞浸泡2分钟，用无菌水淋洗，再用无菌滤纸吸干。取一段2厘米的培养基从中部切开，在断面上用无菌刀片切成米粒大小的块，移入新的斜面上进行培养。
（6）药物处理
菌种提纯时，可向培养基中注入选择性强的抗菌制剂，如加入 5～10毫克/升的多菌灵（MBC）、涕必灵（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培养基中加入30～40毫克链霉素、20～30毫克四环素、金霉素，或50毫克高锰酸钾，可以有效地防止细菌混生；加入灰黄霉素（20单位/毫升），可抑制真菌生长。
（7）破碎菌丝
从试管中取出已污染的培养基，放在0.1%升汞水中处理2分钟，用无菌水冲洗，无菌纸吸干，再放入有玻璃珠的无菌水内，经组织破碎，稀释后注入平板培养，取其单个菌落纯化培养。

⑷ 分离纯化乳酸菌的方法

（1）分离纯化乳酸菌时，首先要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释．泡菜滤液中乳酸菌的浓度高，直接分离很难分离到单个菌落，因此需要对泡菜滤液进行梯度稀释．
（2）在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用是中和乳酸菌代谢过程中产生的乳酸和利于乳酸菌的识别和分离；分离纯化时应挑选出在平板上有透明圈的菌落作为候选菌．
（3）若该同学采用稀释涂布平板法来检测泡菜滤液中乳酸菌的含量，先将lmL泡菜滤液稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0．lmL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37．据此可得出每毫升滤液中的活菌数为=（39+38+37）÷3÷0.1×100=3.8×10 ⁴ 个．
（4）若对筛选得到的乳酸菌进一步纯化，宜采用的纯化方法是平板划线法．乳酸菌在20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的甘油．
故答案为：
（1）泡菜滤液中乳酸菌的浓度高，直接分离很难分离到单个菌落（为了聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落）
（2）鉴别乳酸菌 具有透明圈
（3）3.8×10 ⁴
（4）平板划线法 甘油

⑸ 分离纯化微生物的方法有哪些各方法适用分离什么菌种

主要有：划线法、倒平板法、涂布法，根据分离的菌种选择不同的培养基。

稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效果好。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离。

分离技术

主要是稀释和选择培养，稀释是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线法。

如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。为保证分离到的微生物是纯培养，分离时必须用。

以上内容参考：网络-微生物分离纯化

⑹ 植物内生真菌的鉴定方法步骤有哪些

来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等方法。
（一）来源鉴定法
又称基原鉴定法，是应用植（动、矿）物分类学的知识，对中药的来源进行鉴定，确定其正确的学名，以保证应用品种准确无误。
1．来源鉴定的内容：包括原植（动）物的科名、植（动）物名、拉丁学名、药用部位，矿物药的类、族、矿石名或岩石名。
2．原植物鉴定的步骤：①观察植物形态；②核对文献；③核对标本。
中药的原植物鉴定，除经典分类学方法外，还可使用化学分类学、细胞分类学、数值分类学、DNA分类学方法和技术。
（二）性状鉴定法
就是用眼看、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等十分简便的方法来鉴别药材的外观性状，这些方法积累了丰富的传统鉴别经验，具有简单、易行、迅速的特点。 性状鉴定的内容包括形状、大小、色泽、表面特征、质地、折断面的特征、气、味、水试、火试等。
1． 药材 ：
⑴ 形状 ：药材的形状与药用部位有关，每种药材的形状一般比较固定。
⑵ 大小 ：指药材的长短、粗细（直径）和厚度。
⑶ 色泽 ：药材的颜色与成分有关，颜色是否符合要求，是衡量药材质量好坏的重要因素之一。一般应在自然光下观察药材的颜色，如用两种色调复合描述色泽时，应以后一种色调为主色。
⑷ 表面特征 ：指药材表面是光滑还是粗糙，有无皱纹、皮孔、鳞片、毛茸或其它附属物等。
⑸ 质地 ：指药材的轻重、软硬、坚韧、疏松（或泡松）、致密、黏性、粉性、油润、角质、绵性、柴性等特征。
⑹ 断面特征：包括自然折断面和横切面。
⑺ 气 ：“气”是由于药材含有挥发性物质的缘故，也是药材的重要鉴定特征之一。
⑻ 味：药材的味感是由其所含的化学成分决定的，每种药材的味感是比较固定的。味感也是衡量药材品质的标准之一。
⑼ 水试 ：有些药材放入水中，能产生特殊的现象，如沉浮、溶解情况、颜色、透明度、有无黏性、膨胀度、旋转与否及有无荧光等。
⑽ 火试 ：有些药材用火烧之，能产生特殊的香气或臭气，会有颜色、烟雾、闪光或响声等现象出现，可据此鉴别其真伪甚至优劣。
三）显微鉴定法
是利用显微镜来观察药材的组织构造、细胞形状以及内含物的特征，矿物的光学特性，以及利用显微化学方法，确定细胞壁及细胞内含物的性质或某些品种有效成分在组织中的分布，用以鉴定药材的真伪和纯度甚至品质，以及对中成药是否按处方规定投料进行鉴定。
1．显微制片方法
包括有横切片或纵切片、表面制片、粉末制片、解离组织片、花粉粒与孢子制片、磨片制片、含粉末药材的制剂显微制片等。
2．植物细胞壁和内含物的鉴别
3．显微测量
目镜测微尺先用镜台测微尺标化，然后在显微镜下测量细胞及细胞内含物的大小。通常是在高倍物镜下进行测量，但欲测量较长的纤维、非腺毛等的长度时，则在低倍物镜下测量，记录最大值与最小值。
4．显微常数测定
常见的显微常数主要有用于叶类鉴别的气孔数、气孔指数、栅表比、脉岛数和脉端数等。这些显微常数常因植物种类不同而异，而同种植物则较为恒定，对于叶类、某些带叶的全草类和花类药材的品种鉴定有重要意义。
5．常用封藏试液
⑴ 蒸馏水、稀甘油：适用于观察淀粉粒、油滴、树脂等细胞内含物及细胞壁的颜色。
⑵ 甘油醋酸试液：使淀粉粒不膨胀，特别适宜淀粉粒的观察与显微测量。
⑶ 水合氯醛试液：可使皱缩的细胞膨胀；可溶解多种色素，如叶绿素及树脂、淀粉粒、蛋白质、菊糖、挥发油，而各种晶体不溶解；有清净、透明作用，使细胞、组织透明，便于观察细胞形状和组织构造及细胞内含的各种结晶体。
6．扫描电子显微镜和偏光显微镜的应用
⑴ 扫描电子显微镜：分辨率高，可达3nm，放大倍数一般可达几十万倍，图像富有立体感。
⑵ 偏光显微镜：主要用于观察和分析矿物类中药的光学性质，也可用于研究动物和植物类中药的组织及细胞内含物，如淀粉粒、草酸钙簇晶等。对于透明矿物，一般使用透射光源的偏光显微镜；对于不透明矿物则使用放射光源的偏光显微镜。
（四）理化鉴定法
1．物理常数的测定
包括相对密度、旋光度、折光率、硬度、黏稠度、沸点、凝固点、熔点等的测定。这对挥发油类、油脂类、树脂类、液体类药（如蜂蜜等）和加工品类（如阿胶等）药材的真实性和纯度的鉴定，具有特别重要的意义。
2．一般理化鉴别
⑴ 化学定性分析：利用药材中的化学成分能与某些试剂产生特殊的气味、颜色、沉淀或结晶等反应来鉴别中药的真伪。
⑵ 微量升华：利用中药中所含的某些成分，在一定温度下能升华的性质获得升华物，在显微镜下观察其结晶性状、色泽，或取升华物加试液观察反应。
⑶ 荧光分析：利用中药中所含的某些化学成分在紫外光或常光下能产生一定颜色的荧光的性质进行鉴别。紫外光灯的波长为365nm，如用短波（254～265nm）时应加以说明。
⑷ 显微化学分析：将药材的切片、粉末或浸出物等置于载玻片上，加某些化学试剂后产生沉淀或结晶，在显微镜下观察其形状和颜色进行鉴别。利用显微和化学方法确定中药有效成分在中药组织构造中的部位，称为显微化学定位试验。
⑸ 泡沫指数和溶血指数：利用皂苷的水溶液振摇后能产生持久性的泡沫和溶解红血球的性质，可测定含皂苷类成分药材的泡沫指数或溶血指数作为质量指标。
3．检查
⑴ 水分测定法：2005年版《中国药典》水分测定法有四种，即烘干法、甲苯法、减压干燥法和气相色谱法。
⑵ 灰分测定法：2005年版《中国药典》灰分测定法包括总灰分测定法和酸不溶性灰分测定法。
⑶ 膨胀度的测定：膨胀度是药品膨胀性质的指标，系指按干燥品计算，每1g药品在水或其它规定的溶剂中，在一定的时间与温度条件下膨胀后所占有的体积（ml）。主要用于含黏液质、胶质和半纤维素类的天然药品。
⑷ 酸败度：是指油脂或含油脂的种子类药材，在贮藏过程中发生复杂的化学变化，产生游离脂肪酸、过氧化物和低分子醛、酮类分解产物，因而出现臭味，影响药材的感观性质和内在质量。
⑸ 色度检查：利用比色鉴别法检查药材在贮藏过程中有色杂质的限量，如白术。
⑹ 有害物质的检查：中药中的有害物质主要有内源性的有害物质和外源性的有害物质。
①内源性的有害物质：
②外源性有害物质：
4．色谱法
⑴ 薄层色谱法：是用于定性鉴别最多的色谱法之一。
⑵ 高效液相色谱法
⑶ 气相色谱法：适用于含挥发油及其它挥发性组分的中药及中成药的分析。
⑷ 蛋白电泳色谱法：用于动物药、果实种子类及根茎类等含蛋白质及氨基酸的药材的真伪鉴别。
⑸ 高效毛细管电泳
5．分光光度法
包括紫外－可见分光光度法、红外分光光度法和原子吸收分光光度法。常用波长范围为：200～400nm的紫外光区；400～760nm的可见光区；2.5～25um（按波数计为4000～400cm－1）的红外光区。
6．色谱－光谱联用仪分析法
7．浸出物测定
对某些中药的有效成分尚未清楚或尚无精确定量方法的中药，一般可根据已知成分的溶解性质选用溶剂进行浸出物的测定。通常选用水、一定浓度的乙醇（或甲醇）、乙醚作浸出物测定。有冷浸法和热浸法。测定前供试品需粉碎，使能过二号筛。
8．含量测定
⑴ 含量测定方法：既有经典分析方法（容量法、重量法等）又有现代仪器分析法（如紫外－可见分光光度法、气相色谱法、薄层扫描法、高效液相法等）。
⑵ 挥发油含量测定方法有两种：①甲法适用于测定相对密度在1.0以下的挥发油；②乙法适用于测定相对密度在1.0以上的挥发油。
（五）新技术和新方法简介
1．DNA分子遗传标记技术
2．中药指纹图谱鉴定技术

⑺ 植物内生菌分离方法

植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。 (

⑻ 植物的内生菌怎么提取具体的实验步骤怎么做

这个实验已经有人做过了，不管是实验设计还是浓度确定，都有经典实验了，参照现成的就可以。

具体参见文献“超积累植物龙葵内生菌强化镉植物修复的初步研究”

实验设计具体参见原始文献“BarzantiR,OzinoF,BazzicalupoM,etal.

.MicrobialEcology,

2007,53:306-316”

知网上都有.

⑼ 急急急~请问哪位高人知道植物内生真菌的分离方法

从元江仙人掌的茎中分离到一株产广谱、高活性抑菌物质的内生真菌，经测定对细菌、植物病原真菌和皮肤致病真菌共21种病原微生物有较为明显的抑制作用。形态特征表明，该菌株与曲霉属（Aspergillus）中的土生曲霉（Aspergillus terreus）的特征基本一致，18SrDNA序列分析显示本菌株与土生曲霉的同源性高于99％，但该菌株的分生孢子梗上有明显的瘤状突起，不同于模式菌株。因此认为该菌株为土生曲霉的一个变种，命名为土生曲霉云南变种（Aspergillus terreus vat．yunnanensis）。并对其活性物质的生产条件进行了初步摸索，确定用查氏培养基为最佳种子培养基，PDA培养基为最佳发酵培养基，4d为最适发酵时间。

⑽ 纯化菌种，为了得到单菌落，常采用的接种方法有吗些

常采用的接种方法有两种：一个是平板划线法，另一个是稀释涂布平板法。这俩种最为常用且操作相对简易。