生物大分子浓缩的主要方法有哪些

❶ 如何利用透析法进行脱盐浓缩蛋白

二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex
ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity
chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo
超滤膜的分子量截留值：
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

❷ 生物大分子分离方法和理论依据

一般的有:
层析
电泳
离子交换器

❸ 生物大分子制备主要步骤是什么

生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
②建立相应的可靠的分析测定方法。主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化 学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法、电泳法、以及核磁共振等。
③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。
④生物材料的破碎和预处理。
⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶、电泳、离心、超滤等。目前纯 化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。在实际工作中往往要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定。蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相 色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）进行联合鉴定则更为理想，必要时再做N－末端氨基酸残基的分析鉴定。核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯 酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外吸收法，即测定样品在pH 7.0时260nm与280nm的吸光度（A260和A280），从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。
⑦产物的浓缩，干燥和保存。

❹ 常有的蛋白浓缩方法有哪些

蛋白浓缩方法基本有： 丙酮沉淀法；免疫沉淀法；三氯醋酸沉淀法；硫酸铵沉淀法；（低温）有机溶剂沉淀法；聚乙二醇沉淀法；超滤法；透析法；离子交换层析和冷冻干燥法…… 1.丙酮沉淀法；三氯醋酸沉淀法 试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。 2.免疫沉淀法：得有特异性抗体！ 3.硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析），选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济！ 4.（低温）有机溶剂沉淀法：强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg2+离子，pH值 5.聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀！ 6.超滤法：主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法更不易引起变性！不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的！ 7.透析法：主要用于更换蛋白质的缓冲液！的有透析袋！不需要特殊的仪器！ 8.离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩！ 9.冷冻干燥法：在冷冻状态下让扬品种的液体升华 参考网址on http://www.bio1000.com/experiment/biochemical/351804.html

❺ PEG聚乙二醇浓缩的原理

蛋白质浓缩

浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径

XM －300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

❻ 抗原浓缩的名词解释是什么 急急急

抗原的浓缩
浓缩是低浓度溶液通过除去溶剂(包括水)变为高浓度溶液的过程，在制备生物大分子及各种生化产品时，常在提取后和结晶前进行浓缩，有时也贯穿在整个制备过程中。沉淀(包括盐析和有机溶剂沉淀)，广义上来说也是一种浓缩方法，经过沉淀再溶解，浓度可大大提高，但有时提取液很稀，体积又很大或结晶前除去少量溶剂，则常用其他方法浓缩。
1．蒸发法液体在任何温度下都在蒸发，蒸发是溶液表面的溶剂分子获得动能脱离液面逸向空间的过程。当溶液受热，液体中溶剂分子动能增加，蒸发过程加快。蒸发的快慢和温度、蒸发面积、液体表面积、液面蒸汽分子密度，即蒸汽压大小有关。各种液体在一定温度下都具有一定饱和蒸气压，当液面上的溶剂蒸气分子密度很小，经常处于不饱和的低压状态，液相与气相的溶剂分子为了维持其分子密度的动态平衡状态，溶液中的溶剂分子就必须不断地气化逸出空间，以维持其一定的饱和蒸气压力。因此，根据上述原理，蒸气浓缩装置常按照加热、扩大液体表面积、低压和加速空气流动等因素而设计的。
2．冰冻法冰冻法也是生物大分子及其他有机化合物浓缩的一种有效方法。生物大分子在冰冻时，水分结成冻，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液，用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
吸收法 是一种通过吸收剂直接吸收溶液中的溶剂分子使溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不起吸附作用，易与溶液分开，吸收剂除去溶剂后能重复使用。实验室中最常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝胶等。使用凝胶时，首先选择凝胶粒度大小恰好溶剂及低分子物质能渗入凝胶内，而生物大分子却完全排除于凝胶之外的，然后将洗净和干燥的凝胶直接投入待浓缩的稀溶液中，凝胶亲水性强，在水中溶胀时，溶剂及小分子被吸收到凝胶内，生物大分子留下剩余的溶液中，离心或过滤除去凝胶颗粒，即得已浓缩的生物大分子溶液。凝胶溶胀时吸收水分及小分子物质可同时起到浓缩及分离纯化两种作用，对生物大分子结构和生物活性都没有影响。是近年来生物化学及分子生物学日益广泛使用的浓缩和分离方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收剂时，需先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，扎紧袋口，外加聚乙二醇复盖，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶剂饱和后，可更换新的，直到浓缩至所需的浓度为止。用完一次以后的聚乙二醇经过加热除去溶剂便可再次使用。
4．超滤法超滤法是使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。当溶液在一定压力下(外源氮气压或真空泵压)通过膜时，溶液和小分子透过，大分子受阻保留于原来溶液中，其原理如图2—2所示。这一近年发展起来的新方法是适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持生物大分子生理活性、回收率高等优点。除去浓缩、脱盐外，并可应用生物大分子的分离纯化，是目前民展较快且为人们所采用的生化技术之一。
图2-2超滤法示意图
通过超滤法，蛋白质和酶的稀溶液一般可浓缩到10%～15%浓度，回收率高达90%。超滤法应用关键在于膜选择。不同类型的规格的膜、水的流速(在规定压力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量数值)等参数均不同，必须根据工作的需要来选用。此外，超滤装置形式、溶质成分及性质、溶液浓度及粘度都对超滤的效果有一定影响。
制品浓缩到一定程度，即可贮存，如有必要可采用低温干燥(冰干)的方法除去制品中溶剂，使之成干粉。
制品的贮存可分干态贮存和液状贮存。但不论是何种方法贮存，都要避免长期暴露在空气中，防止微生物的污染。温度对生物活性物质的活性影响很大，在绝大多数情况下应采取低温保存。
干态储藏：干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，在低温情况下，生物大分子活性可在数个月甚至数年没有显着变化。储藏方法也很简单，只将干燥后的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，保持0～4℃冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，可先将样品分装成许多小瓶中，每次用时，只取一小瓶。
液态储藏：液态储藏的优点是使样品减去干燥这一步骤，生物大分子的生理活性和结构破坏较少，缺点是需要较严格的防腐措施，储藏时间不能太长。如样品量大时封装运输不方便，实验室常采取少量安瓿封存方法。液态储藏注意事项如下：
样品不能太稀，必须浓缩至一定浓度后才能封装储藏，样品太稀时容易引起生物大分子变性作用。
一般需加入防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和酶常用的稳定剂有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和辅酶以提高其稳定性，此外钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也具有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸与氯化钠的标准缓冲液中。

❼ 常用的浓缩方法有哪些如何选择合理的浓缩途径

常用的浓缩方法就是加热蒸发法，使水分蒸发，使溶液浓缩。

利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白质溶液放入透析袋扎紧，把高分子[分子量(MW)：6 000～12 000]聚合物如聚乙二醇或蔗糖等撒在透析袋外即可。但在使用聚乙二醇时在个别情况下会使蛋白质稍有变性。

透析袋浓缩法：

而优点是形成的平衡时间较短，通常到达30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀。另外也可将吸水剂配成30%～40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。操作时应在4℃环境中，以免蛋白质变性。吸水剂用过后，可放入烘箱中烘干反复使用。

❽ 浓缩DNA方法有哪些(至少三种)

鄙视楼上的答非所问！
三种方法：
1，沉淀后复溶；
2，吸附后洗涤；
3，冻干

❾ 研究生物大分子的基本方法有哪些

生物大分子的基本制备技术有：盐析，透析，超滤和浓缩冷冻干燥

❿ 细胞生物学11

蛋白质、酶和核酸这三大类物质都是生物大分子，它们都具有十分重要的生理功能。酶是生物催化剂，核酸是遗传信息的携带者，蛋白质是生命现象的基础。因此对生物大分子的结构与功能的研究，具有十分重要的理论和实践意义。而这研究的首要条件是制备高纯度的生物大分子，否则对其结构与功能的研究就无从谈起。

2．制备方法的分类：

依理化性质，分离、纯化生物大分子的方法可分四个类型：

(1)按分子大小和形态：采用高速离心、过滤、分子筛、透析等方法。

(2)按溶解度：采用盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配、结晶等方法。

(3)按电荷差异：采用电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析、吸附层析等方法。

(4)按生物功能专一性：采用亲和层析法。

3．制备的总体思路：

一般可分为六个阶段：

(1)材料选择与预处理：动物、植物和微生物都是制备生物大分子的材料，选什么材料主要依靠实验的目的而定，选材料时应注意以下几个问题：

①使用的目的：从科学实验的特殊需要出发，选材时需求能符合实验预定目标即可。

②材料的生理状态差异：选材时要注意植物的季节性，微生物的生长期和动物的生理状

态。如：微生物生长的对数期，酶与核酸的含量较高。

材料选定后，通常要进行预处理，如动物组织要剔除结缔组织，脂肪组织等非活性部位，植物种子先行去壳、除脂、微生物需将菌体和发酵液分离开，暂时不用材料尚需冰冻保存。

（2）细胞的破碎及细胞器的分离

①细胞的破碎：除了提取液和细胞外某些多肽激素、蛋白质和酶不需破碎细胞膜，对于细胞内和多细咆生物组织中各种生物大分子的分离提纯都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，不同生物体，或同一生物体的不同组织，其细胞破碎难易不一致，因此使用方法也不完全相同，通常两种方法共同使用。

A． 高速组织捣碎机

玻璃匀浆器

研磨

机械切力的作用

物理方法：

反复冻融法

冷热交替法

超声波处理法

加压破碎法

物理因素的作用

B．化学及生物化学法

自溶法

溶菌酶处理法

表面活性剂处理法

改变细胞膜透性法

但是，不管采用哪种方法，都需要在一定稀盐溶液或缓冲溶液中进行，且需加某些保护剂，以防止生物大分子的变性及降解。

②细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，通常破碎细胞后，先分离各组分，以防干扰，这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的，细胞器的分离，一般采用差速离心法，此法是利用细胞各组分质量大小不同，在离心管不同区域沉降的原理，分离出所需组分，分离得到的细胞器，其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。

(3)提取：

提取又称抽提或萃取，其作用是将经过处理或破碎了的细胞置于一定的条件和溶剂中，让被提取的生物大分子充分地释放出来，提取效果如何，取决于该物质在溶剂中溶解度的大小和该物质的分子结构及使用溶剂的理化性质。原则地说，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性有机溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂中；温度高时，一般溶解度相应增大，在远离生物大分子等电点的pH值时溶解度增加，从细胞中提取生物大分子也受扩散作用的影响和分配定律的支配。由于影响因素较多，在实际制备时应根据经验并结合具体实验条件灵活地加以应用。

(4)分离纯化

从细胞中提取出来的生物大分子是不够纯净的，常含许多同类的或异类的物质，必需进一步分离纯化才能获得纯品。生物大分子制备工作中，分离纯化这一步既重要又复杂，主要方法可归纳为两类：

①对异类物质的分离：常采用专一性酶水解，有机溶剂抽提，选择性分部沉淀和液固相转化透析分离等方法。

②对同类物质的分离：常采用盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶、电泳、超离心、柱层析和吸附等方法。

(5)浓缩与结晶

①浓缩是指低浓度溶液通过除去溶剂(包括水)变为高浓度溶液的过程，常在提取后结晶

前进行，有时也贯穿在整个制备过程中。浓缩的方法常采用：

A．蒸发法：薄膜蒸发浓缩，减压加温蒸发浓缩，空气流过蒸发浓缩。

B．冰冻法。

C．吸收法。

D．超滤法。

②结晶是指使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。结晶除作为生化制备一种纯化手段外，其结晶化合物还常常是生物大分子结构的分析研究的材料，常用以下几种方法进行结晶。

A，盐析法：加固体盐法、加饱和盐溶液法、透析法。

B．有机溶剂法。

C．等电点法。

D．脱盐结晶法。

E．加金属离子结晶法。

(6)干燥与保存：

干燥是指将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分(或溶剂)蒸发除去的过程，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥。

保存是指样品如何存放的问题，保存方法与生物大分子的稳定性密切相关，常采用干态贮藏和液态贮藏的方法。干态贮藏法就是将干燥后的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，保持0—4℃冰箱中即可；液态储藏法，首先免去烦杂的干燥过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，但应注意样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储藏，必需加入防腐剂和稳定剂。常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等。另外要求储藏温度较低，大多数在0℃左右冰箱保存，有的则要求更低的温度。但不管采用哪种方法，都必须避免长期暴露在空气中，以防微生物的污染。

(二)鉴定

经过一系列的分离纯化，所得到的物质是不是我们所需要的，样品的纯度如何，都需要进行进一步的鉴定，包括纯度鉴定、性质与功能鉴定，结构鉴定等，鉴定的方法也很多，具体实验中可根据研究的需要选择某些方法。

1．纯度鉴定

(1)电泳法：纯的蛋白质、核酸样品在它稳定的范围内，在一系列不同的PH条件下进行电泳时，都以单一的泳动速度移动，因此在区带电泳中，它的电泳图谱只有一个条带，蛋白质一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋纤薄膜电泳等，核酸样品一般采用琼脂糖电泳。

(2)沉降分析法：纯的蛋白质、核酸样品在离心力的影响下，以单一的沉降速度运动，离心后只能得到一个条带。

(3)恒溶度法：纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量。在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质的量为横座标，以溶解的蛋白质的量为纵座标作图，如果蛋白质样品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在折点之前，直线的斜率为l，在折点以后，斜率为零，不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个或两个以上的折点。

2．性质与功能鉴定

(1)分子量测定：蛋白质、核酸样品都可以通过适当的实验方法，测定出样品的分子量。蛋白质可以采用渗透压法、沉降分析法、通透层析法、SDS-PAGE电泳法等，核酸样品可采用琼脂糖电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。

(2)蛋白质等电点测定：可通过等电聚焦电泳法。

(3)功能鉴定：具有酶或激素性质的样品可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量，

而不具有酶或激素活性的蛋白质，可以先用来免疫适当动物，一般会产生抗体，利用抗原—抗体反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量，这些生物学方法的测定和总蛋白质测定配合起来，可以用来研究蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的提纯程度，提纯程度常用这一特定成分与总蛋白之比来表示，提纯工作一直要进行到这个比例不再增加为止。

3．结构鉴定

(1)末端测定：可采用DNS—氨基酸或DNP—氨基酸聚酰胺薄膜层析法测定。

(2)组成分析：把样品完全水解后进行氨基酸或核苷酸的组成分析，并计算出各种氨基酸或核苷酸的分子比。

(3)“指纹”分析：将制备的样品与标准样品在相同条件下用蛋白酶或核酸内切酶进行部分水解，再进行电泳，通过电泳图谱的比较，可以判断所分离到的样品是否是所需要的成分。

(4)序列测定。

(5)探针技术：把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，然后用已放射性标记或酶标记的针对特定氨基酸序列或核苷酸序列的特异性试剂作为探针检测之。探针技术特异性强，灵敏度高，而且样品无需经过复杂的分离纯化即可进行鉴定，因此在分子生物学中得到了广泛的应用。目前主要有三种技术：

①Southern blotting：1975年由Southern提出的转移技术，通常用来对DNA特定序列进行定位、鉴定。先将DNA样品通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体(通常是硝酸纤维膜或尼龙膜)上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记的DNA或RNA片段作为探针与固着在固相支持体上的DNA进行杂交，经放射自显影后可以确定与探针互补的DNA片段的电泳条带的位置。

②Northern blotting：1977年由Alwine等提出的转移技术，可用于测定总RNA或poly

(A)+RNA样品中特定mRNA分子的大小和丰度。 RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分离，随后将RNA转移至活化纤维素、硝酸纤维膜、玻璃或尼龙膜，用放射性标记的与待测RNA分子互补的DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影，以对待测的RNA分子进行作图。

③Western blotting：1979年由Towbin等人提出的蛋白质转移技术，用于对非放射性标

记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。通常使用的探针是抗体，它可与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应，先将待测样品溶于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持体上(常用硝酸纤维滤膜)然后可被染色，随后滤膜可与抗靶蛋白的非标记抗体反应，最后结合上的抗体可用多种放射性标记或酶偶联的二级免疫学试剂进行检测。