测定蛋白质等电点有哪些方法

❶ 现有一未知的水溶性蛋白质,如何确定其等电点请设计实验

摘要 一、目的：

❷ 请问：怎样知道某种植物蛋白质的等电点

科技名词定义
中文名称：等电点 英文名称：isoelectric point 定义：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。符号为pI。 所属学科： 生物化学与分子生物学(一级学科) ；氨基酸、多肽与蛋白质(二级学科)

等电点聚焦测蛋白质等电点

一、实验原理

等电点聚集实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方

法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性电解载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的PH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的PH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为零的区带，这时的PH则是这种蛋白质的PI。IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的PH梯度。也即找到合适的两性载体。

二．实验试剂

1．丙烯酰胺单体储液

丙烯酰胺[Aa]30%[W/V]，甲叉双丙烯酰胺[Bis]0.8%[W/V]

2．核黄素 0.025%[W/V]

3．Ampholien PH3.5-9 凝胶工作液 Aa：Bis 1ml

甘油 0.25ml

Ampholine PH 3.5-9 0.4ml

双蒸水 3.25ml

摇匀，用水泵抽气10分钟，加入0.025%核黄素0.15ml，摇匀后用滴管灌入玻管中。

4．25%[W/V]蔗糖水溶液，用于配制蛋白样品

5．10%蔗糖水溶液，用来铺于样品层上部。

6．电极液： 上槽 0.02M H3PO4 1000ml

下槽 0.01M NaOH 600ml

7．染色液： 0.01%考马斯亮蓝R-250

5%三氯乙酸

5%磺基水杨酸

三．实验仪器与器具

玻璃管4×120mm 4支

封口膜

试管架

细长滴管

注射器及长针头

玻片、刀片

10ml玻璃瓶

微量可调移液器

圆盘电泳槽及电泳仪

四．操作步骤

1．圆柱体凝胶制备，用封口膜将玻管（4×120mm）的一端封口，将玻管套上橡皮塞，加入凝胶混合液至10cm处，轻轻铺上一层双蒸水，置于日光灯下待其聚合。

2．聚焦电泳

（1）将电泳下槽注入0.01M NaOH、将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳槽（注意塞紧所有的孔，以防电极液下露）。将上槽连同电泳管置于下槽上，此时凝胶下端与电极液接触，注意排除凝胶下表面的气泡。

（2）加样100μl蛋白含量2-5μg。

（3）在样品上轻轻一层10%的蔗糖，直至顶端，作为隔离层。

（4）上槽注入0.02M H3PO4，注意不要搅混样品层和隔离层。

（5）接上电源，正极接酸，负极接碱。恒定在120V，通电16-18小时至电流降至0为止。

3．蛋白质染色及等电点测定：

（1）取胶 将凝胶后的含样品的凝胶借助长注射器针头注水取出。

（2）蛋白样品的染色由于两性载体Ampholine可与多种蛋白染色剂结合，并形成不溶性复合物，因此一般需要染色前除去Ampholine。本实验直接将凝胶置于三氯乙酸中浸泡，立刻可见蛋白带。

（3）PH梯度测定 取液，分别加入于10只小玻璃瓶中，将欲测的PH梯度的胶条置于玻璃片上，用刀片切成长的小段，按顺序放入有编号的小玻璃瓶中，盖好橡皮塞，将凝胶段在室温下浸泡过夜，次日用PH计测每支小瓶中浸泡液PH值。将得到的PH值对凝胶长度作图，得标准曲线。

（4）样品的PH值测定。测定出染色蛋白带的位置，在PH梯度曲线上求出相对应PH值既是此样品的PI。

五．实验结果

测定十个小管中胶条的PH分别为7.14、7.86、7.50、6.96、6.38、5.74、5.10、4.49、4.13。以胶条距碱端的距离为横坐标，PH值为纵坐标作图：

经过测量，待测蛋白距碱端为7.3cm，浸泡后胶的总长度为10.5cm，等比例换算得距离应为6.95，带入公式得待测蛋白的PI值为：4.64 查表得知与牛血清白蛋白的等电点接近。

六、讨论

1、载体两性电解质含量2％~3%比较适合，能形成好的梯度。

2、制胶用丙稀酰胺最好是重结晶的。过硫酸铵要新配的。所有的水都要用重蒸水。

3、样品必须无盐，否则电泳时样品条带可能走歪，拖尾或者根本不成条带。加样的量要适当，避免过多电泳后条带不清晰。

4、由于碱性漂移作用，胶条碱端最初1cm的pH值过低，故作图时舍去。

（5）本实验结果中同时加入待测和以前提取两种蛋白（未发现条带,可能样品含盐量过大），待测蛋白在三氯乙酸中固定后即可看到明显的白色条带，故未用染色液染色即可测量迁移距离。

❸ 蛋白质等电点的测定方法

●方法：平板等电聚焦
●原理：蛋白质分子在含有载体两性电介质形成的连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。但不自是按照等电点不同被分离。
●仪器：Bio-Rad Model 111Mini IEF Cell
●样品要求：
●液体：浓度>3mg/ml；体积>200ul；固体：质量>200ug
●样品纯度>90%；含盐量<3 0mM；分子量：一般要求大于1000Da
●常见影响测试情况:
1、蛋白质纯度不足
2、含盐量过高
3、蛋白质分子量太小，导致无法固定染色

❹ 测定蛋白质等电点的方法的原理是什么

蛋白质是两性电解质，蛋白质在碱性溶液中成阴离子，在酸性溶液中成阳离子；蛋白质分子所带净电荷为零时的ph值称为蛋白质的等电点（pi）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。
各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在ph12.0~12.4。近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋白质在不同ph溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的ph值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。

❺ 蛋白质等电点的测算方法

等电点：如果调节溶液的PH值使得其中的氨基酸呈电中性，我们把这个PH值称为氨基酸的等电点：PI。PI是氨基酸的重要常数之一，它的意义在于，物质在PI处的溶解度最小，是分离纯化物质的重要手段。等电点的计算：对于所有的R基团不解离的氨基酸而言（即解离只发生在α-羧基和α-氨基上），计算起来非常简单：PI＝（PK1’+PK2’）/2若是碰到R基团也解离的，氨基酸就有了多级解离，这个公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aaCysAspGluLysHisArgPK’α-羧基1.712.692.192.181.822.19PK’α-氨基8.339.829.678.959.179.04PK’-R-基团10.78（-SH）3.86（β-COOH）4.25（γ-COOH）10.53（ε-NH2）6（咪唑基）12.48（胍基）在这种情况下可以按下面的步骤来计算：<1>由PK’值判断解离顺序，总是PK1’<PK2’<PK3’<…，即谁的PK’值小，谁就先解离。<2>按照解离顺序正确写出解离方程式：简式，注意解离基团的正确写法。<3>找出呈电中性的物质，其左右PK’值的平均值就是氨基酸的等电点：PI＝（PK左’+PK右’）/2以Lys为例：在黑板上用简式演示<3>
等电点的测定：等电聚焦法：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将氨基酸点样，只要该处的PH与氨基酸的PI不同，则氨基酸就会带电，PH值>PI时，aa带-电；PH值<PI时，aa带+电。通电后，氨基酸就会移动，直到某处的PH＝PI，氨基酸才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。
等电点沉淀
所有的氨基酸均为两性物质，亦即它们至少含有一个酸性基（carboxyl）及一个碱性基（α-amino）。这些可游离的团基在pH变化时，因释出或接受质子而可充当弱酸或弱碱，其离子化特性与其它物质一样遵守Henderson-Hasselbalch方程式：
pH=pKa+log10[未质子化的形式（碱）]/[已质子化的形式（酸）]
即
pH=pKa+log[A-]/[HA]
氨基酸可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）或双极性离子（dipolarion）及负电荷（anion）等三种，若在酸性溶液中带正电荷，则在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。因为净电荷为零，净电斥力不存在的缘故，大部份蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度最小。相反的，当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子所带净电荷必为同号，彼此之间有相斥力，不会凝结。所以，将pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质将会沉淀，这种现象可以应用于估算某蛋白质的等电点.

❻ 在蛋白质等电子测定过程中,如何根据实验现象判断酪蛋白的等电点

根据实验现象判断酪蛋白的等电点的方法：
1）最小溶解度法。蛋白质在不同pH溶液中形成不同的浊度来测定，即最大浊度处的pH值为蛋白质的等电点值。浑浊最严重时的pH值，即为酪蛋白的等电点。
2） 等电聚焦法。等电聚焦完成后，切成胶条，测量不同段的pH值，并用三氯醋酸显色，即可确定酪蛋白的等电点。

❼ 解释如何蛋白质等电点的测定

一、目的：
了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

二、原理：
蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。

蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，蛋白质在碱性溶液中成阴离子，在酸性溶液中成阳离子：

蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。
各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH12.0~12.4。近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。

四、操作步骤：
1．制备蛋白质胶液
（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水。
（2）加入50毫升1 mol·L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1 mol·L-1醋酸溶液50毫升，摇匀。
（4）加入蒸馏水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1mol·L-1 NaAC溶液中的酪蛋白胶体。
2．等电点测定
按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。

观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。

❽ 测定等电点的方法有哪些

交错分配法。
对一种特定的蛋白质，在不同盐系统中，pH和其分配系数之间的关系应不同，而在等电点时，得到的均为不带电时分子的分配系数。对不同的盐系统，其等电点时的分配系数应相等，两条pH和分配系数关系的曲线必交于一点，该点所对应的pH值即为该特定蛋白质的等电点。根据这一原则测定蛋白质等电点的方法，称为交错分配法

❾ 测定蛋白质等电点的方法的原理是什么

等电聚焦电泳（IFE,isoelectric focusing electrophoresis）
利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度,电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷）,形成一个很窄的区带.
还有一种是根据蛋白在等电点时的溶解度来测定,配制一系列不同pH的缓冲液,测定蛋白质的溶解度,溶解度最小的pH就是蛋白的pI.

❿ 测定蛋白质等电点的方法的原理是什么

蛋白质是两性电解质，蛋白质在碱性溶液中成阴离子，在酸性溶液中成阳离子；蛋白质分子所带净电荷为零时的ph值称为蛋白质的等电点（pi）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。
各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在ph12.0~12.4。近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋白质在不同ph溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的ph值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。