定位突变技术包括哪些常用方法

1. 基因定位诱变是啥呀

在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异性改变称为基因的定向诱变。利用这项技术一方面可对某些天然蛋白质进行定位改造，另一方面还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋白质结构及功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象及生物活性之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。一般而言，含有单一或少数几个突变位点的基因定向突变可选用下列五种策略，而大面积的定位突变则采取基因全合成的方法。

1 局部随机掺入法

将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒的特定位点上，其上游紧接着两个酶切位点RE1和RE2，它们分别能产生5’和3’突出的单链粘性末端。用大肠杆菌核酸外切酶III末端特异性降解经RE1和RE2双酶切开的重组质粒3’凹端，并通过酶解反应时间控制新生成的单链区域大小（单链区域越短，突变精度越高）。终止反应后，单链区域用Klenow酶补平，底物除四种正常的dNTP外，还包括一种特殊结构的脱氧核糖核苷酸类似物，在缺口填补过程中，该类似物掺入到DNA链的一处或多处。随后再用S1核酸酶处理单链末端，并以T4-DNA连接酶连接成环。重组分子转化大肠杆菌，在体内复制过程中，由于类似物的碱基配对非特异性，50%的扩增产物分子内部引入了错配碱基，并导致位点突变。由这种方法产生的突变体一般含有几对取代碱基，而突变的区域则取决于外切酶III末端降解的程度。

2 碱基定点转换法

能导致碱基定点转换的最简单方法是使用某些化学试剂在体外诱变DNA分子。通常将质粒DNA或待突变DNA片段用诱变剂处理后，转化大肠杆菌，构建突变体文库。最常见的体外诱变剂为亚硫酸氢钠，在DNA单链的情况下，它能特异性地使胞嘧啶残基脱氨形成尿嘧啶残基。处理后的DNA单链再由DNA聚合酶体外转化为双链结构，在复制过程中，原DNA分子上的CG碱基对便转换成TA碱基对。从表面上看这种方法所引入的突变并非定点，但如果合适地控制诱变剂的处理条件，便能做到每个DNA单链分子只含单一转换的碱基，而且其位点随机分布，这样即可在样本庞大的突变体文库中挑选出在期望位点上突变的重组分子。
除了上述化学诱变外，还可以借助于酶促合成对DNA分子进行所有可能的碱基对转换。其原理是使单链DNA在不理想的反应条件下进行体外复制，如较高或较低的离子强度、不平衡的四种核苷酸底物浓度以及缺少从3’至5’核酸外切活性的DNA聚合酶（Taq）等。在体外DNA聚合反应系统中，如果某种核苷酸底物浓度过低，当模板要求该底物时便有可能为其它三种底物所取代，从而导致序列突变。

3 部分片段合成法

如果在待突变的位点上下游含有合适的限制性内切酶识别序列，尤其当多个待突变位点集中分布在该区域时，可考虑直接化学合成这一片段，在此过程中将欲突变的碱基设计进去，然后以此人工合成的寡聚核苷酸片段置换重组质粒上对应的待突变区域，即可完成基因的定点突变。部分片段合成法特别适用于系统改变功能蛋白的氨基酸序列，并在体内观察突变位点对蛋白质生物功能的影响，从而确立突变前这些氨基酸残基对蛋白质结构和功能的贡献。例如，在大肠杆菌噬菌体433和P22阻遏蛋白分子中，-螺旋-转角--螺旋结构域与操作子DNA的结合特性就是用上述方法研究的。

4 引物定点引入法

引物定点引入法实质上是一种寡聚核苷酸介导的定点诱变方法，它能在克隆基因内直接产生各种点突变和区域突变。首先将待突变的目的基因克隆在M13-RF DNA载体上，转化大肠杆菌，挑选重组噬菌斑，从中分离出重组DNA正链；人工合成与待突变区域互补的寡聚核苷酸引物，并在此过程中设计引入突变碱基，然后在较温和条件下与重组DNA正链退火，经DNA体外复制和连接后，双链分子重新转化大肠杆菌；以上述合成的寡聚核苷酸片段为探针，在严格条件下（如将杂交温度提高5-10℃）杂交筛选含有突变碱基的噬菌斑，从中分离纯化出RF DNA双链分子进行克隆表达。相似地，若要在DNA特定位点上插入或缺失一段，也可设计合成特殊结构的寡聚核苷酸引物，并将之引入待突变区域。但须注意的是欲插入或缺失的DNA片段应小于引物本身的长度，否则退火操作相当困难。
从理论上来讲，在DNA体外复制并克隆后，携带突变碱基的噬菌斑应为重组噬菌斑总数的一半，但由于技术上的原因，这种期望的噬菌斑通常只有1～5%。为了特异性富集突变体便于筛选，可将待突变的重组M13-RF DNA分子首先转化具有t和ung两个DNA代谢酶基因缺陷的大肠杆菌受体菌株。前者由于不能合成dUTP水解酶，致使细菌细胞内dUTP含量急剧上升，在DNA体内复制时，dUTP部分取代dTTP掺入到DNA新生链中；后者为尿嘧啶糖基化酶基因缺陷，这种变异株丧失了切除DNA链中脱氧尿嘧啶核苷酸残基的能力。由该菌株产生的重组M13 DNA正链分子中大约有1%的T为U所取代，经体外复制后，再将双链DNA分子导入正常的大肠杆菌受体细胞中。此时，该菌的尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的脱氧尿嘧啶核苷酸残基，使原来的模板链降解，而突变链因不含U被完整地保留下来。

5 PCR扩增突变法

将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒上，重组分子分在含有两种不同引物的反应管A和B中。在A管内，引物I与克隆基因的区域互补，并含有唯一一个错配碱基（即突变位点），引物II则与载体区域完全互补，使得两个引物的末端位于待突变位点的右侧；在B管内，两个引物均与克隆基因互补，但引物III含有一个错配碱基，引物IV则完全互补，两个引物的末端位于待突变位点的左侧。经若干轮PCR扩增反应后，积累的双链DNA产物均为线型平头分子。将A、B两管的扩增产物混合变性并退火，只有I-III和II-IV杂合双链呈交叉缺口的环状结构且含有突变位点，这种分子不经连接可直接转化大肠杆菌，而其它组合形式的杂合双链则为线型分子，通常难以形成克隆。

2. 如何用基因组学的方法定位一个突变基因

基因组(GENOME)一词是1920年Winkles从GENes和chromosOEs铸成的，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。

1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学(Genomics)，指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。因此，基因组研究应该包括两方面的内容:以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional

genomics)，又被称为后基因组(postgenome)研究。

功能基因组学(Functuional genomics)又往往被称为后基因组学(Postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入对基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括:生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰;细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径;发育上功能，如参与形态建成等。采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析，新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析(serial analysis of gene

expression,SAGE)，cDNA微阵列(cDNA microarray)，DNA 芯片(DNA chip)等。

结构基因组学是基因组学的一个重要组成部分和研究领域，是一门通过基因组作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。

功能基因组学是利用结构基因组所提供的信息，发展和应用新的实验手段，通过在基因组水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因转向多个基因或蛋白质的研究同时进行系统研究的科学。

3. 基因定向突变的技术的方法和原理

不论是真核生物还是原核生物的突变，也不论是什么类型的突变，都具有随机性、稀有性和可逆性等共同的特性。
①随机性。指基因突变的发生在时间上、在发生这一突变的个体上、在发生突变的基因上，都是随机的。在高等植物中所发现的无数突变都说明基因突变的随机性。在细菌中则情况远为复杂。
②稀有性。突变是极为稀有的，野生型基因以极低的突变率发生突变。
③可逆性。突变基因又可以通过突变而成为野生型基因，这一过程称为回复突变
。正向突变率总是高于回复突变率，一个突变基因内部只有一个位置上的结构改变
才能使它恢复原状。
④少利多害性。一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰或是死亡，但有极少数会使物种增强适应性。
⑤不定向性。例如控制黑毛a基因可能突变为控制白毛的a+或控制绿毛的a
说白了，随机性指的是突变的发生是随机的，何时何地何人是不一定的。
不定向性指的是突变的效果千奇百怪，如同本来是白色的可以变成红橙黄绿青蓝紫等等任何一种颜色都有可能。

4. 蛋白质工程中定点突变技术的原理及流程

通过多聚酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等。定点突变能迅速，高效地改变DNA所表达的目的蛋白，从而影响生物性状，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

定点突变需要设计特定的突变引物。引物长度一般为25-45 bp，建议选择30-35bp长度的引物p。引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求引物两边都能与模板搭上，所以引物的两边各设至少12个bp。

定点突变实验注意事项

1、引物设计时须参照引物设计原则，注意引物中的GC含量，引物长度等，可在引物的两端选择G或者C，可以提高引物和模板结合的概率。

2、PCR过程中未得到相应大小条带或条带不单一，应适当调整退火温度，已调整聚合酶和引物的特异性。

3、使用一轮PCR产物进行第二轮PCR时，需等量加入作为模板的PCR产物的mol量。

4、某些特殊的限制性酶切酶处理基因时需要进行65℃灭酶处理（如I-CEUI,PI-SCEI），以使内切酶变性和DNA分离。

5、连接后转化，注意载体中的抗性基因，可以设置空白对照，已转化后得到的单菌落数量评估获取阳性克隆的概率。

5. 常用的基因突变检测方法有哪些

1、焦磷酸测序法

测序法的基本原理是双脱氧终止法，是进行基因突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。但其过程繁琐、耗时长，灵敏度不高，对环境和操作者有危害，故在临床应用中存在一定的限制。

焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。

焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力。为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

2、微数字聚合酶链反应

该方法为将样品作大倍数稀释和细分，直至每个细分试样中所含有的待测分子数不超过1个，再将每个细分试样同时在相同条件下聚合酶链反应后，通过基因芯片逐个计数。该方法为绝对定量的方法。

3、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。该法一般用于检测已知的突变位点。

因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中兇手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

4、高效液相色谱法

该方法是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异而进行检测的，可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。

与测序法相比，该法简单、快速，不仅可用于已知突变的检测，还可用于未知突变的扫描。但只能检查有无突变，不能检测出突变类型，结果判断容易出错。

5、单链构象异构多态分析技术

依据单链DNA在某一种非变性环境中具有其特定的第二构象，构象不同导致电泳的迁移率不同，从而将正常链与突变链分离出来。与测序法相比，灵敏性更高。

6. 什么是基因的定位诱变

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组,也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化）,包括碱基的添加、删除、点突变等.定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是基因研究工作中一种非常有用的手段.
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段.蛋白质的结构决定其功能,二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一.对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构,对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系,探讨蛋白质的结构/结构域.而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光,经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造,现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移）,而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等.定点突变技术的潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNA作用元件,提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构,以及药物研发、基因治疗等等方面.

7. 实时定向基因突变技术是什么意思

基因定向突变是指通过聚合酶链式反应等方法向目的DNA片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。

方法原理：基因突变定向诱变利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化，从而收到定向的诱变效果。

定向突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。