Ⅰ 基因克隆的策略有哪些
利用计算机来协助克隆的第一步是必须获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列，标准：长度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。可通过数个万维网界而使用BLAST检索程度实现，其中最常用的如NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GenBank、意大利Tigem的ESTmachine（包括EST提取者和EST组装机器）、THC（Tentative Human Consensus Sequences）数据库、ESTBlast检索程序——通过英国人类基因组作图项目资源中心（Human Genome Mapping Project Resource Center，HGMP—RC）服务器上访问。然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。获得这些EST序列数据后，再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如凤有精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。基因分析的结果大致有三种：第一是已知基因，是研究对象为人类已鉴定和了解的基因；第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。新基因和未知基因将进一步用于生物学研究。
Ⅱ 从生物体克隆目的基因的方法有哪些
1.PCR扩增克隆法
PCR扩增克隆法是在已知植物基因序列的基础上，进行基因序列克隆的一种方法。先从基因文库（genebank）中找到有关基因序列，据此合成一对寡聚核苷酸引物，从植物中提取染色体DNA或RNA，进行PCR扩增。扩增的片段纯化后插入合适的质粒载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列比较，以获得目的基因。
2.功能克隆法
功能克隆（functionalcloning）是根据性状的基本生化特征，在鉴定已知基因功能后进行克隆。该法在纯化相应的编码蛋白质后，构建cDNA文库或基因组文库。然后从文库中用下述两种方法进行基因筛选，其一是将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因；其二是将编码蛋白质制成相应抗体探针，从cDNA载体表达文库中筛选相应克隆。实行功能克隆的关键步骤是分离出高纯度蛋白质。对于产物不明的基因，不能利用这一方法进行克隆。
3.定位（图位）克隆法
定位（图位）克隆法（positionalcloning）根据目的基因在染色体上的位置，进而通过染色体步移（chromosomewalking）进行克隆。需预先建立具有目的基因的适宜遗传分离群体（近等基因系或分离群体），将目的基因精确定位在染色体特定的位置之后，用目的基因两侧紧密连锁的分子标记（RFLP标记）为探针，筛选基因组文库，得到阳性克隆，然后以阳性克隆的末端作为探针，获得含有目标基因的大片段克隆，然后以这些新的DNA为探针，获得更趋近目的基因的DNA片段，不断缩小筛选区域，逐步向目的基因靠近，最终克隆到该基因。
4.转座子标记法
转座子（transposon）是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段，而原来位置的DNA片段（转座子）并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝。基因转座可引起插入突变，使插入位置的基因失活，并诱导产生突变型。通过标记基因就可以检测出突变基因的位置，进而克隆该突变基因。这样将转座子作为基因定位的标记，并通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因称为转座子标记法（transposontagging）。para>5.减法杂交法
该法根据植物表现型差异或基因在不同组织或器官的表达差异来克隆植物基因。特异性表达的基因，其mRNA表现不同。分别从表达特异性基因的植物组织和无特异性基因的组织中提取mRNA，反转录为cDNA，两者杂交。在两种组织中都表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因，这一策略被称作减法杂。
6.mRNA差异显示法
该法可有效鉴别并克隆差异表达的基因。提取不同的mRNA后可用共同的引物反转录成cDNA，进行PCR扩增，获得差异表达的cDNA序列，作为探针，在cDNA文库或基因组文库中筛选基因，并作功能分析。该法可直观筛选差异表达的基因，比减法杂交操作方便、迅速，需要总RNA量少，效率高，短期内可完成cDNA的扩增、鉴定和克隆。
Ⅲ 基因克隆有哪些步骤，如何筛选阳性克隆
简单的说一下：
1.
扩增目的基因，比如通过PCR的方法。
2.
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO
TA的方法插入到载体质粒。
3.
转染大肠杆菌
4.
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。
5.
挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。
Ⅳ 怎样克隆一个目的基因
目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。
常用的植物目的基因克隆技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定
这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。
2、通过遗传表型分析
（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。
（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共’�虮嗦氲氖芴逯�浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担�圆≡�し⒆拥鞍孜�咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共’�颍�绶�延胛薅净�騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。
3、以图谱为基础的定位克隆技术
以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。
Ⅳ 目标基因克隆的主要方法有哪些
基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。
一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。
Ⅵ 基因克隆的常用方法有哪几种
根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(highstringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节省时间。
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