细菌总数的测定方法有哪些

❶ 化学原理检测菌数量

化学原理检测菌数量：细菌总数检测目前国标规定的方法为平板计数法。

在玻璃平皿内，接种一毫升水样或稀释水样于加热液化的营养琼脂培养基中，冷却凝固后在37°C培养24小时，培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为细菌总数，有的国家把培养温度定为35°C或其他温度，也有把培养时间定为48小时的，这种方法精度高，难以满足实际工作需要。

含义

不同于研究尺度更小的粒子物理学与核物理学，化学研究的原子、分子、离子（团）的物质结构和化学键、分子间作用力等相互作用，其所在的尺度是微观世界中最接近宏观的，因而它们的自然规律也与人类生存的宏观世界中物质和材料的物理、化学性质最为息息相关。作为沟通微观与宏观物质世界的重要桥梁。

❷ 食品中细菌总数和菌落总数是怎么样测定的

食品中细菌总数和菌落总数的测定方法如下：

平板培养计数法

实验方法原理

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1 g或1 ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 实验材料

琼脂培养基 食品检样

试剂、试剂盒

乙醇生理盐水氢氧化钠溶液

仪器、耗材

电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘、天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质器、乳钵、灭菌刀、剪刀、灭菌镊子、酒精、棉球、玻璃、蜡笔、登记薄

实验步骤

一、检验程序

菌落总数检验程序见图5—1

二、检样稀释及培养

1. 以无菌操作，将检样25 g(或25 mL)剪碎以后，放于含有225 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预先置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8 000 r／min—1 0000 r／mln的速度处理1 min做成1：10的均匀稀释液。

2. 用1 mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1 mL，沿管劈徐徐注入台有9 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同)，振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。

3. 另取1 mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。

4. 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。

5. 稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基[可放置在(45土1) ℃水浴锅内保温注入平皿15 mI一20 mL，并转动平皿位混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1 mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。

6. 待琼脂凝固后，翻转平板，置(36土1) ℃恒温箱内培养(48土2) h取出板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得I g(1 mL)样品所含菌落总数。

注意事项

1. 平板培养计数法只能检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数，总是比实际生存在食品中的细菌数要少，这是因为食品中存在多种细菌，它们的生活特性各异，不可能在统一培养条件下全部生长出来。但是，仍能借此评定整个食品被细菌污染的程度，所以目前一般食品的卫生检验中都普遍采用这种方法。

2. 平板菌落计数测定食品中的菌落总数，一般均采用中温培养，特别是已属于直接供食用的制成食品，因为这些食品卫生的要求，是严格防止消化道传染病病原菌和食物中毒病原菌污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因而测定细菌数时，采用中温培养是比较合理的。

❸ 水中细菌总量的测量方法

• 基本原理

  应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。

• 操作步骤

  
  

1．水样的采取

(1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
(2)池水、河水或湖水应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。

2．细菌总数测定

(1)自来水
①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。
②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。
④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。
⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。
(2)池水、河水或湖水等
①稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。
一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。

3．菌落计数方法

(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
(2)首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。
(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。
(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

❹ 统计活菌数量的方法都有哪些

统计菌落数目的方法有直接计数法和间接计数法两种。
1. 直接计数法
直接计数法是将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4〜5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每 毫升样品中所含的细菌数。计算公式 为:每毫升原液所含细菌数=每小格平 均细菌数X400X1 000X稀释倍数。这种方法的优点是所需设备比较简单，能迅速得到结果，而且在计数的同时还可以观察到所研究的微生物的形态特征； 缺点是不能区分死菌与活菌。
2. 间接计数法
在应用稀释涂布平板法计数时，首先要将待测样品配制成均匀的系列稀释液，尽量使微生物细胞分散开，再把稀释液接种到平板上，进行培养观察。但值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌 的实际数目低，而且统计的结果一般用 菌落数而不用活菌数来表示。计算公式为:每克样品中的菌落数= (C+V)X M，其中，C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V表示涂布平板时所 用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

❺ 归纳概括细菌检验方法

10种常用的细菌检测方法

一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：
1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。
2、用台盼蓝（1% Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。
3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。
5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。
6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。
二、MTT检测法：
1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
三、XTT检测法：
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。
四、MTS检测法：
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。
2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。
5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
五、NAG检测法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。
3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
六、AlamarBlueTM摄入法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。
3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。
七、碱性磷酸酶检测法（AKP法）：
1、按MTT法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用PBS洗去死亡细胞，洗两次。
2、向96孔细胞培养板各孔中加0.2ml新鲜配制的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲伞基磷酸）。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3小时。
3、在荧光计数仪上测定荧光的量。根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。
八、三磷酸腺苷检测法（ATP法）：
1、ATP反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。在4℃可以保存1个月。用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75 Tris-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在－20℃长期保存。
2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中（每孔含100μL细胞培养液），每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。
3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入20μl ATP反应液，立即检测10秒钟的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。
4、用RLU（Y轴）对细胞因子标准品的稀释度（X轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。
九、染料染色法测定细胞数：
1）结晶紫检测法：
1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。
2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。
3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。
5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6、测定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性
2）NBB检测法：
1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。
2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。</P< p>
3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。
4、每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。
3）美蓝染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05%美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在665nm波长处测定光吸收度。计算TNF的活性。
4）中性红染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl 5%中性红染液。继续培养2小时。
2、小心倒去培养液。用200μl Hanks液洗涤细胞1次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。
3、每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。在550nm波长处测定OD值。
十、直接计数细胞：
1、如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。直接在血细胞计数板上计数细胞。
2、如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。
3、计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10 000×2×1/4。

❻ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

❼ 细菌总数的检验方法是什么

细菌总数是水质参数之一，指单位体积水中的细菌总量。其检验方法是:在玻璃平皿内,接种一毫升水样或稀释水样于加热液化的营养琼脂培养基中，冷却凝固后在37°C培养24小时，培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为细菌总数。有的国家把培养温度定为35°C或其他温度，也有把培养时间定为48小时的。

❽ 细菌菌落总数的测定方法

菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。

❾ 食品安全检验中细菌总数的测定有哪几中方法

现在一般是用平板计数法，以前的标准是用营养琼脂，新标准时用平板计数琼脂。还可以用快速测试纸检验。前者比较普遍。

❿ 细菌总数测定方法可分为什么法和什么法

细菌总数测定方法可分为什么法和什么法
现在一般是用平板计数法，以前的标准是用营养琼脂，新标准时用平板计数琼脂。还可以用快速测试纸检验。前者比较普遍