‘壹’ 过氧化氢酶活性的测定 高锰酸钾滴定法 紫外分光光度法各有什么优缺点
过氧化氢酶活性测定，是根据过氧化氢酶（PHD）能催化过氧化氢生成氧的特性，常用碘量法和电极法。
前者通过测定PHD催化H2O2反应后剩余的H2O2与碘化物作用生成碘量的变化计算PHD活性。该法设备简易，但操作复杂，误差较大。后者的原理是H2O2为有电活性物质，但经PHD催化后其产物为无电活性物质，用铂电极来测量PHD催化前后电流变化引起电压的变化，测出PHD活性大小。还可应用分光光度法、瓦氏呼吸仪检压法、硫酸高铈法等。紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
‘贰’ 说明测定过氧化氢酶活力的方法有哪些，原理各是什么
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低.根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性.
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）.
【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度.混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液.5℃下保存备用.
‘叁’ 除高锰酸钾外，还有什么方法可以测定过氧化氢的含量
过氧化氢(Hydrogen peroxide)
化学式： H2O2过氧化氢含量测定,过氧化氢含量,H2O2过氧化氢含量测定,过氧化氢含量,H2O
相对分子质量： 34.01
结构式:
说到过氧化氢，可能很多小伙伴会想就是实验室里那种俗称双氧水，外观为无色透明需要避光的液体。它是一种强氧化剂，其水溶液适用于医用伤口消毒及环境消毒和食品消毒。然鹅，过氧化氢可没这么简单，它在生物体内广泛存在，而且是一种关键的调节因子。过氧化氢含量与细胞状态有密切关系呢。
可能有人不理解这种强氧化剂咋会在生物体内存在，我们就来说说：
过氧化氢是生物体内最常见的活性氧分子，是一种活性氧代谢的副产物，主要由 SOD 和 XOD 等催化产生，由 CAT 和 POD 等催化降解。过氧化氢不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H2O2 可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面 过氧化氢也是许多氧化应急反应中的关键调节因子。过氧化氢可以激活NF-κB等因子，这些过氧化氢相关的信号途径和哮喘、炎症性关节炎、动脉硬化以及神经退行性疾病等许多疾病相关。过氧化氢也和细胞凋亡、细胞增殖等密切相关。
看来过氧化氢在生物体内确实发挥重要作用呢，所以过氧化氢含量的测定就有重要的意义。我们下面简单介绍几种常用的测定过氧化氢的方法：
一、二甲酚橙（xylenol orange）法
这种方法在国内应用比较广泛，有明显的优势。
原理：过氧化氢氧化二价铁离子产生三价铁离子，二甲酚橙（xylenol orange）高选择性的结合三价铁离子形成有色（紫色）产物，可用比色法在580nm处测定。从而实现对过氧化氢浓度的测定。
由于二甲酚橙（xylenol orange）作为一种金属离子络合指示剂，与三价铁离子的结合有很高的选择性，也就是该方法有很好的特异性。同时该反应需要在酸性条件下进行，可以消除很多物质的干扰。
二、硫酸钛比色法
这也是国内一种比较常见的方法。
原理：H2O2与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在 415nm 有特征吸收。
该方法原理简单易懂，但样本处理需要自备丙酮用来破碎细胞、匀浆组织和稀释液体样本。丙酮易挥发，而且易燃有毒，给操作带来一定困难，需要做好防护措施。
三、探针法
这是目前国外一种常用的测定过氧化氢含量的方法。
原理：在辣根过氧化物酶（HRP）存在的条件下，特异的 探针与过氧化氢反应，生成有色产物在570nm有最大光吸收，也可产生红色荧光（Ex/Em=535/587 nm）。比色法与荧光法灵敏度不同，需要配制不同的标准曲线。
该方法需要用到特异性的荧光探针，反应原理较前面2种复杂，但灵敏度很高，在荧光法中灵敏度可达40 nM。
四、过氧化物酶底物法
这是一种国外不太常见的方法。
原理：用一种独特的过氧化物酶底物测定溶液和细胞提取物中的过氧化氢 ，在辣根过氧化物酶（HRP）存在的条件下，过氧化氢氧化无色的过氧化物酶底物，产生强烈的蓝色。在 650nm有特征吸收。
‘肆’ 测定过氧化氢酶活力的方法有哪些，原理各是什么
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低.根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性.
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L
pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L
H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）.
【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2～3ml
4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度.混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液.5℃下保存备用.
2.测定：取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表40-2顺序加入试剂.
表40-2
紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管
号
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性.
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）.
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中
A240
=
AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1,
AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）.
‘伍’ 过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L
pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L
H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml
4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2
紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管
号
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中
A240
=
AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1,
AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
‘陆’ 过氧化物酶活性测定的方法有哪些
实验
48
过氧化物酶活性的测定（比色法）
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在
470
nm
处有最大吸收，可用分光光度计测量
470
nm
的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂
1
．
100
mmol
／
L
磷酸缓冲液
pH6.0
（见附录）。
2
．反应混合液：
100
mmol
／
L
磷酸缓冲液（
pH6.0
）
50
mL
于烧杯中，加入愈创木酚
28
μl
，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入
30
%
过氧化氢
19
μl
，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，
100
mL
容量瓶，吸管，
离心机。
三、实验步骤
1
．称取植物材料
1
g
，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以
4000
r
／
min
离心
15
min
，上清液转入
100
mL
容量瓶中，残渣再用
5
mL
磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2
．取光径
1
cm
比色杯
2
只，于
1
只中加入反应混合液
3
mL
和磷酸缓冲液
1mL
，作为对照，另
1
只中加入反应混合液
3
mL
和上述酶液
1mL
（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长
470
nm
下吸光度值，每隔
1min
读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以
ΔA
470
/[min
•
g
（鲜重）
]
表示之。也可以用每
min
内
A
470
变化
0.01
为
1
个过氧化物酶活性单位（
u
）表示。
过氧化物酶活性
[u/
（
g
•
min
）
]=
式中：
Δ
A
470
——反应时间内吸光度的变化。
W
——植物鲜重，
g
。
V
T
——提取酶液总体积，
mL
。
V
s
——测定时取用酶液体积
,
mL
。
t
——反应时间，
min
。
‘柒’ 如何测定过氧化氢酶活性
一、目的
过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握测定过氧化氢酶活性的原理和方法。
二、原理
过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢量来表示，当酶与底物（H2O2）反应结束后，用碘量法测定未分解的H2O2量。以钼酸铵作催化剂，使H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应式为：
H2O2 + 2KI + H2SO4 —→I2 + K2SO4 + 2H2O
I2 + 2Na2S2O3 —→2NaI + Na2S4O6
根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差，即可求出过氧化氢酶分解H2O2的量。
四、实验步骤
1. 过氧化氢酶的提取
选取甘蔗功能叶片，擦净去主脉剪成碎片，混匀后迅速称取1g放入经冷冻过的研钵中，加少量CaCO3粉末及石英砂，并加入3～4ml蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，用蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过滤。然后再取滤液10ml至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释液。
2. 酶活性测定
2.1取100ml容量瓶4个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml，立即向3、4号瓶中加入1.8mol·L－1H2SO4 5ml以终止酶活性，作为空白测定。
2.2将各瓶放在20℃水浴中保温5～10min（若室温超过20℃则以室温为准）。保温后向各瓶准确加入 0.018％H2O2 5ml, 摇匀并记录酶促反应开始时间。
2.3将各瓶放在20℃水浴中让酶与底物（H2O2）作用5min。时间到后迅速取出，立即在1、2号瓶中加入1.8mol·L－1H2SO4 5ml以终止酶活性。
2.4向4个瓶中各加入20％KI 1ml和3滴10％(NH4.)6MO7O4，摇匀，用0.02 mol·L－1 Na2S2O3
滴定至淡黄色后再加入5滴1％淀粉液作指示剂，再用0.02 mol·L－1 Na2S2O3滴定至蓝色刚消失为滴定终点，记录Na2S2O3用量。