影响酶免疫组化方法的因素有哪些

㈠ 影响酶活性测定准确性的因素有哪些

1．底物浓度 除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10～20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。
2．酶浓度 在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。
3．温度 不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37℃。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示。温度系数指温度每升高10℃，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l～2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。
4．离子强度和pH值 在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5～8之间。在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。血浆或血清标本含有多种缓冲溶质，具有较强的缓冲能力。为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响，使pH不致偏离设定值，标本用量不宜过大，血浆或血清标本体积／反应液体积≤1／10为宜。
5 辅助因子 某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的辅基，Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基，NADH是不需氧脱氢酶的辅酶。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。
6．激活剂 有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，Cl-是淀粉酶的激活剂。因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。
7．抑制剂 酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+，K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制。抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。

㈡ 免疫组化实验染色的注意事项及影响因素有哪些

免疫组化染色影响因素
影响免疫组化染色质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。
1。假阴性反应可发生在：
1) 组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低；
2) 抗原被遮盖，多由于醛类固定剂的使用，使组织中的大分子蛋白借醛键形成交联而遮盖待检抗原；
3) 抗体质量不佳或稀释度不当；
4) 技术操作失误等。
2．假阳性反应可发生在：
1) 抗体与非待检抗原发生交叉反应，在使用多克隆抗体时易出现；
2) 组织对抗体的非特异性吸附，特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时容易发生；
3) 内源性过氧化酶的作用，在脾脏、骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出现；内源性碱性磷酸酶的作用，特别是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果；
4) 判断失误，将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组织化学阳性信号误认为是肿瘤的染色反应；
5) 当肿瘤浸润破坏正常组织时，使被破坏的正常细胞胞浆内的可溶性蛋白释放，后者被肿瘤细胞非特异吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反应；⑥外源性和内源性色素的干扰。

㈢ 影响酶免疫组织化学技术的因素有哪些

免疫组化技术对于研究 肿瘤的发展规律，进行良恶性分类及鉴别诊断具有重要的作用。免疫组化染色的结果，与组织的固定、抗原的修复、抗体的保存及使用三个重要因素相关密切。
1、 固定
常用的组织固定液是甲醛，标本必须及时固定，这有利于抗原的保存，防止抗原在组织细胞内弥散、丢失或失去免疫活性，但固定时间最好为!" 小时，一般不超过"# 小时，因固定时间越长，部分组织细胞免疫组化标记敏感性会明显降低。其原因为甲醛固定过程中会形成醛键或羧甲基，而封闭了部分抗原决定簇；也会使蛋白与蛋 白之间发生交联，也可能会封闭抗原决定簇，使许多抗原如常用的$%、&$’( 等免疫反应明显减弱，甚至消失，致酶标不能得出正确的结果，因此在染色时为取得良好的染色效果，必须对有些抗原进行预先修复，以进一步暴露抗原。
2、 修复抗原
外检组织经过甲醛固定、脱水透明及浸蜡过程，组织中的抗原成分已被破坏或封闭，为了恢复组织的抗原性和提高组织对抗体的敏感性，一般需 修复抗原。有人用蛋白酶消化，或微波处理，或高压锅处理，使封闭的抗原成分暴露出来而显色。我们采用高温高压处理切片，切片在弱酸及高温高压下，

使 封闭的抗原显示出来，提高了阳性检出率和阳性强度，同时减轻了背景着色，使阳性结果清晰可辨。当然，不同组织、不同抗原其所用的高压时间及选用合适的抗原 修复缓冲液及其最适的.’ 等均对结果影响甚大。我科一般采用+/+! 012 3 ( 柠檬酸钠缓冲液（.’ -/ +）作为抗原修复液，高温高压时间以!+ 045 显色效果最好，且几乎无脱片发生。实践证明，高压处理技术应用于免疫组织化学具有经济、简便、阳性率高、定位准确、染色清晰等优点，容易推广应用。

3、 正确保存及使用抗体
抗体是免疫组织化学最基本的试剂与材料，它可分为第一抗体与第二抗体，因为抗体是蛋白质构成，保存或使用不当，不但会造成浪 费，而试剂变质会出现假阴性结果。对抗体及6 , 7 试剂盒均应放置低温冰箱贮存，用一支取一支，对于一次用不完的抗体可保存在# 8冰箱内，而不要放在冰格室，因为那里的温度在+ 8以下，抗体会很快结冰，再次使用时又要溶解。这样几次冻融，抗体效价会急剧下降而失效。对一些将近失效期或已过失效期，有的适当
提高工作浓度， 也可以作出正确的结果，以免丢失造成浪费。

㈣ 影响酶促反应的因素是什么

温度、酸碱度、酶浓度、底物浓度、抑制剂。

酶促反应速度达到最大时的环境温度称为酶的最适温度。高于或低于最适温度，酶促反应速度均降低。人体内各种酶的最适温度在37℃左右。

在一定温度、pH条件下，当底物浓度大于酶浓度时，酶促反应速度与酶浓度成正比例关系。

酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。使酶活性降低或丧失的物质称为抑制剂。抑制分为竞争性抑制和非竞争性抑制，在酶活性测定过程中，应尽量避免抑制剂存在。但在有的反应体系中，加入竞争性抑制剂可以提高工具酶的米氏常数。

在一定温度、pH条件下，酶浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度的关系呈矩形双曲线。底物浓度很低时，反应速度与底物浓度成正比；底物浓度再增加，反应速度的增加趋缓；当底物浓度达某一值后，反应速度达到最大，反应速度不再增加。

酶促反应速度达到最大时的反应体系的pH称为酶的最适pH。pH低于或高于最适值，酶促反应速度均降低。人体内多数酶的最适pH接近于7，但也有例外，如胃蛋白质酶的最适pH为1.8；肝精氨酸酶的最适pH为9.8。

㈤ 影响酶活性的因素有

摘要 您好，影响酶活性的主要因素是温度和pH值。其中温度比较重要，人体内酶的活性在37摄氏度是最佳。生物酶各自适应的酶的温度不同。植物光合作用酶的活性在20摄氏度左右最强。在一定的范围内，酶的活性随着温度的升高而升高，但是温度过高会使酶失活。

㈥ 影响酶促反应的因素有哪些用曲线表示他们的影响为什么会产生这些影响

影响酶促反应的因素：
分三个方面：
1 浓度影响：酶浓度，底物浓度，产物浓度等。
2 外界因素（环境因素）：压力，PH值，溶液的介电常数与离子强度，温度等。
3 内部因素（结构因素）：底物浓度及效应物，酶结构等。

其中用到较多的是浓度影响，温度，PH值的影响等，结构因素就要从分子的角度去解释。

浓度的影响很容易解释，酶浓度和底物浓度高了，自然反应会快。对于产物而言，经常会出现反馈抑制现象，所以产物浓度高了，往往会抑制反应的进行。

温度和PH值的影响，他们的曲线都是“钟形”的。
其中对于温度而言，一定的酶促反应都是由正向的酶促反应与酶的失活反应的复合。当时间一定，随温度的升高，反应速率增大，转化率提高，但当温度高于某一值时，由于酶的热失活速率加快，当快于酶促反应速率上升的速度时，酶的总反应速率下降，最终降为零。对某一反应时间，就有一与最高转化率对应的温度，该温度称为最适温度。不同的反应时间，有不同的最适温度。最适温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。

㈦ 影响酶免疫组织化学技术的因素有哪些

1.温度：酶促反应在一定温度范围内反应速度随温度的升高而加快；但当温度升高到一定限度时，酶促反应速度不仅不再加快反而随着温度的升高而下降。在一定条件下，每一种酶在某一定温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度。
2.酸碱度：每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活性，超过这个范围酶就会失去活性。
3.酶浓度：在底物足够，其它条件固定的条件下，反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其它不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度与酶浓度成正比。
4.底物浓度：在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度增加而加快，反应速度与底物浓度近乎：成正比，在底物浓度较高时，底物浓度增加，反应速度也随之加快，但不显着；当底物浓度很大且达到一定限度时，反应速度就达到一个最大值，此时即使再增加底物浓度，反应也几乎不再改变。
5.抑制剂：能特异性的抑制酶活性,从而抑制酶促反应的物质称为抑制剂。
6.激活剂：能使酶从无活性到有活性或使酶活性提高的物质称为酶的激活剂。

㈧ 影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

（三）间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

（四）竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

（五）捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

（六）应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

㈨ 简要说明影响酶促反应的因素有哪些，如何影响的

1.温度：酶促反应在一定温度范围内反应速度随温度的升高而加快；但当温度升高到一定限度时，酶促反应速度不仅不再加快反而随着温度的升高而下降。在一定条件下，每一种酶在某一定温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度。
2.酸碱度：每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活性，超过这个范围酶就会失去活性。
3.酶浓度：在底物足够，其它条件固定的条件下，反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其它不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度与酶浓度成正比。
4.底物浓度：在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度增加而加快，反应速度与底物浓度近乎：成正比，在底物浓度较高时，底物浓度增加，反应速度也随之加快，但不显着；当底物浓度很大且达到一定限度时，反应速度就达到一个最大值，此时即使再增加底物浓度，反应也几乎不再改变。
5.抑制剂：能特异性的抑制酶活性,从而抑制酶促反应的物质称为抑制剂。
6.激活剂：能使酶从无活性到有活性或使酶活性提高的物质称为酶的激活剂.

㈩ 影响酶作用的因素

酶的催化活性的强弱以单位时间（每分）内底物减少量或产物生成量来表示。研究某一因素对酶促反应速率的影响时，应在保持其他因素不变的情况下，单独改变研究的因素。影响酶促反应的因素常有：酶的浓度、底物浓度、pH值、温度、抑制剂、激活剂等。其变化规律有以下特点。（1）酶浓度对酶促反应的影响在底物足够，其他条件固定的条件下，反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速率与酶浓度成正比。（2）底物浓度对酶促反应的影响在底物浓度较低时，反应速率随底物浓度增加而加快，反应速率与底物浓度近乎成正比；在底物浓度较高时，底物浓度增加，反应速率也随之加快，但不显着；当底物浓度很大，且达到一定限度时，反应速率就达到一个最大值，此时即使再增加底物浓度，反应速率几乎不再改变。（3）pH对酶促反应的影响每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活性，超过这个范围酶就会失去活性。在一定条件下，每一种酶在某一个pH时活力最大，这个pH称为这种酶的最适pH。（4）温度对酶促反应的影响酶促反应在一定温度范围内反应速率随温度的升高而加快；但当温度升高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度。（5）激活剂对酶促反应的影响激活剂可以提高酶活性，但不是酶活性所必需的。激活剂大致分两类：无机离子和小分子化合物。（6）抑制剂对酶促反应的影响抑制剂使酶活性下降，但不使酶变性。抑制剂作用机制分两种：可逆的抑制作用和不可逆的抑制作用。