抗体与固体载体偶联方法有哪些

㈠ 酶联免疫吸附分析法主要有哪三种

双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

双抗体夹心法

一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。

在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

间接法测抗体

间接法

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。

间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。

⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

捕获法

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

㈡ 酶联免疫反应吸附试验（ELISA）共有几种类型各有什么特点

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

（三）间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

（四）竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

（五）捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

（六）应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

㈢ 指出ELISA有哪几种常用方法各种方法在操作上有什么异同

• 也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，操作步骤如下：

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• 1） 将特异性抗体与固相载体联结。RF是一种自身抗体，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

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• 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇。

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• 2;夹心复合物"，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去，以提高试验的特异性.间接法测抗体

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• 间接法是检测抗体常用的方法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

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• 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，测知标本中抗原的量，直接包被不易成功，可采用捕获包被法、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

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• 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体。

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• 4.竞争法测抗体

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• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质;（conjugate）：

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• 1）将特异性抗原与固相载体联结，故称为间接法。操作步骤如下，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。此法中受检标本不需稀释。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

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• 5.竞争法测抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，应注意可测范围的最高值，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质;（immunosorbent）、ayr，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.双抗原夹心法测抗体

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• 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：

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• 1.双抗体夹心法测抗原

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• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果、adw，固相载体上只留下特异性抗体；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"：（1）固相的抗菌素原或抗体，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，在检测过程中标本须先行稀释（1。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

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• 4）加底物显色

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• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

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• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，可直接用于测定，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

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• 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

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• 3） 加酶标抗体。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，已被列为这类试剂的一项考核指标。

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• 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色、AFP。

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• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，寻找合适的标记方法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，试验中也发生假阳性反应:40~1:200）。IgG的吸附性很强，即"免疫吸附剂"，例如HBsAg，但应尽可能予以纯化。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E，从而消除RF的干扰。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。竞争法测抗体有多种模式，因此其敏感度相对高于间接法；（3）酶反应的底物、ayw4个亚型，因其不能形成两位点夹心，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

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• 2）加稀释的受检血清、HBeAg，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，以避免过高的阴性本底影响结果的判断，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

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• 2） 加受检标本、药物等ELISA测定多用此法。

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• 6.捕获包被法测抗体

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• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式。

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• 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性

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㈣ ELISA在兽医临床上的应用有哪些都包括哪几种方法

（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

㈤ 免疫学中竞争法的基本原理是什么（抗原与抗体间）

1、把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2、把抗原或抗体与某一种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

(5)抗体与固体载体偶联方法有哪些扩展阅读：

在抗原和抗体概念确立后，人们对其理化性质、抗原与抗体特异性结合的化学基础等问题产生了兴趣。20 世纪初， Landsteiner 等应用偶氮蛋白的人工结合抗原，即以芳香族有机化学分子偶联到蛋白质分子上形成的抗原，研究抗原抗体反应特异性的物质基础，从中认识到，抗原特异性实际上是由一些小分子的结构及构象决定的，进而提出了关于抗原抗体反应的格子学说，从理论上解释了血清学反应现象。

20 世纪 30 年代， Tiselies 和 Kabot 建立了血清电泳技术，证明抗体是丙种球蛋白，并利用分离、纯化抗体的方法对抗体分子的结构与功能进行研究。Grubar 等人建立了免疫电泳技术，发现了抗体分子的不均一性的本质，从而使抗体分子与结构研究取得了重大进展。

㈥ 抗体怎么和另外的一个蛋白质偶联

我曾经做过小分子和蛋白质的偶联，有一些自己总结的综述，你可以参考以下：
人工抗原合成常用的载体
载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素(antibiotic)或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；其次，载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子；载体还应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能；而且载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。
常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4，大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下，一部分成为质子，另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性，可与半抗原中的对应基团结合。当然，这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境。牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸，故有许多自由氨基存在，且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度。此外，这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时，其活性基团仍呈可溶状态，因此，这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质[30]。近年来，有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体，表现出能增加半抗原的免疫原性，从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加，被广泛应用[31，32]。
1.2.2人工抗原合成方法
小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法，常用的方法如下：
1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐的中间体，再与蛋白质的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物
2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物（见图1.5）。EDC被称作零长度交联剂之一，因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。
此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1～2h，置室温24h，再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后，也可用上述方法进行偶联。
1.2.2.2含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及pH6.0～8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。
2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物（见图1.6）。
1.3.2.3含羟基半抗原的偶联
1）琥珀酸酐法：半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体)，再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基（图1.7）。
2）羰基二咪唑法：N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。含羟基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。
1.2.3影响人工抗原质量的因素
人工抗原免疫原性的好坏，与多种因素有关。对不同的物质，影响免疫原性的因素并不完全相同，常常需要在得到抗体后对免疫偶合物的具体合成方法进行重新调整。但总的说来，影响人工抗原质量的因素主要有：
1) 偶联比
偶联比过去人们认为，联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明，过多的半抗原并不能得到预期的结果，这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时，可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。实际上，每个载体分子连接上一个半抗原分子就足以产生抗体。有人认为，以BSA为例，连接到蛋白分子上的半抗原数以5～20为宜。而荣康泰等用不同的载体制备对氧磷的人工抗原时，却发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。
2) 偶联桥
有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强，如吴颂如等［34］发现，通常愈远离载体蛋白的基团，其特征反应愈明显。但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。Sionf等［35］认为可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足：一是半抗原上相同位点结合蛋白质，但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥；二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥，但与不同半抗原位点结合。Frieia［36］研究农药酶免疫分析多年，他认为最好的偶联桥是3～6个直链的碳原子结构。
3）半抗原的分子空间结构
用来作半抗原的分子最好有分支结构，直链分子难以产生抗体。此外，有些抗生素(antibiotic)或农药有多个可供蛋白质偶联的位点，但据研究报道，不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别，这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。如合成灭草松和吡虫啉人工抗原时，当利用半抗原不同位点与载体结合时产生的抗体效价和亲合力明显不一样[37、38]。因此，如果一个分子内有多个不同的结合位点时，最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后，通过比较，筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。
1.2.4人工抗原的质量评定
1.2.4.1浓度测定
人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量（mg/ml）是一致的（这里也反映出人工抗原越纯，检出的浓度值愈准确）。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。这里就不一一介绍了。

1.2.4.2纯度鉴定和结构分析
鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则可初步证明人工抗原合成成功。
半抗原与载体分子反应后是否真正的连接在一起，如果发生连接，它们的连接基团又在哪里。这些问题可以通过红外吸收光谱图或质谱分析得到解决。
利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。前者适应范围广，但鉴别的灵敏度较低。后者是用于大分子大分子酶标记物和某些半抗原偶联物的纯度鉴定。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有有利的未偶联的物质。

1.2.4.3偶联比的测定
1）分光光度法
根据赵肃清等人的说法［39］，如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠)，则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数（可以参考文献[30]中的279-283页计算）。
2）标记抗原示踪法
在制备半抗原-蛋白质结合物时，向反应液中同时加入一定量的标记半抗原，反应完成后，未结合的半抗原经透析除去，测定透析前后的放射性强度，就可以计算出结合百分比。再依反应时加入的蛋白质摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的分子数。如果不用透析，也可取一定量反应后的溶液，加入蛋白质沉淀剂或有机溶剂以提取结合的半抗原，测定半抗原-蛋白质结合物的放射性。同样可以计算出半抗原与蛋白质的偶联比。

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㈦ 简述酶联免疫吸附实验有哪些技术类型。

（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

㈧ 可用于elisa的抗体有哪些类型

• ELISA的类型
  ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
  （1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原
  或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情
  况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要
  有以下几种类型：

• 2.2.1 双抗体夹心法测抗原

• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
  1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
  2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
  洗涤除去其他未结合物质。
  3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合
  的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
  4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
  在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合
  物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
  物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相
  载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标
  抗体一起保温反应，作一步检测。
  在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标
  抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应
  后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的
  吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现
  象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
  时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
  增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用
  高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
  假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可
  用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
  问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
  性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
  双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗
  体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
  有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用
  F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体
  夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
  双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小
  分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

• 2.2.2 双抗原夹心法测抗体
  反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应
  的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需
  稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采
  用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

• 2.2.3 间接法测抗体

• 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗
  体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
  1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
  2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗
  体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程
  中被洗去。
  3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗
  体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，
  固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
  4）加底物显色
  本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包
  被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
  间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结
  果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发
  生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物
  质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反
  应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
  间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的
  特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体
  上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检
  测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

• 2.2.4 竞争法测抗体

• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特
  异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体
  量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯
  度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被
  法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的
  杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本
  和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本
  与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的
  抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

• 2.2.5 竞争法测抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法
  进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
  抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
  小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

• 2.2.6 捕获包被法测抗体

• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断(early diagnosis)中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或
  IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的
  IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人
  IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的
  干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕
  获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入
  抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作
  用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗体的检测模式见图2-7。
  类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和
  IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子
  量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量
  244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分
  子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，
  其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生
  物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲
  和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系
  统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶
  标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性
  糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的
  链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通
  ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

㈨ 什么是酶联免疫法

酶联免疫法是将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法。基本原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
酶联免疫法别称
ELISA，ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
(9)抗体与固体载体偶联方法有哪些扩展阅读；
用于临床检验的酶联免疫法检验；双抗体夹心法测抗原法，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作“一步法”检测。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
参考资料；搜狗网络--酶联免疫法

㈩ 酶联免疫检测的几种方法及其原理

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
（2）夹心法（sandwich
assay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法（indirecr
ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。