1. 细胞方式有哪些
细胞式生产方式有:
(一)实行单件流(One-piece-flow)作业
要求产品在生产时一次一件完成整个流程,而完成的速率则由顾客的需求来决定。单件流作业有利于公司快速交货给客户,减少了存储和传输需求,降低了货物被损坏的风险。
但是单件流只是一种理想状态,在实际生产中,不可能也没有必要总在某一个时间只流一个产品。细胞式生产方式所关注的是流过整个流程的材料,力求以最少的延误保证产品流的畅通。
(二)进行弹性生产
要求生产者将在同样设备上,并以同样流程制造的类似的产品归为一组,同时努力减少进行机种转换所需要的时间,建立便于各工序转移的作业机制,以避免因为频繁更换生产线花费过多时间而不能及时满足客户的不同需求。
(三)培养多能工
传统大批量生产方式将复杂的生产工艺,分解成众多的容易掌握的工序,每个工人只完成一个工序,而细胞式生产方式将生产线划分为若干独立的“细胞生产线”, 每个工人必须熟练掌握尽可能多的工序,以避免传统生产方式由于作业不平衡、安排作业不当等在工序交接上花费大量等待时间的弊端。
细胞式生产方式要求工人从“零件人”转变为“完整人”, 把蓝领工人从传统大批量生产方式中解放了出来。
(四)采用扁平化管理
细胞式生产方式要求企业改变以往金字塔式的管理体制,采用扁平化的管理方式,以使信息在传递过程中的损耗降低到最低,以便企业能根据市场形势的变化随时作出应变,制定相应的生产计划并执行。
(五)开展TPM活动
TPM(Total Proctive Maintenance),也就是全面生产性维护,TPM活动要求企业全体员工做到自己的工厂自己管理、自己的设备自己维护,每个人都在TPM活动中有自己的角色。这种全体参与的形式有利于发挥设备的最大效能,保证持续生产,同时也能够增强团队的创造力和凝聚力,使企业充满活力。
以上内容参考:网络-细胞式生产方式
2. 细胞模型制作方法
关于这种制作方法,可以考虑的方法有三:
方法一
首先,考虑一个真核细胞模型制作所需要的零件,即细胞各部分结构尤其是各种细胞器,包括细胞核、液泡、叶绿体等,材料我自然选取了硬纸卡,由于以前手工课剩下的纸卡不够了,我就剪了一个饼干盒子作为细胞壁;接着做细胞核,为了使其富有立体感,我选择了塑料泡沫,并用水彩颜料染上紫色;我认为做内质网的最好材料是紫色毛线,但是条件不允许,所以我选择了塑料网,也染上了紫色;叶绿体和线粒体分别用彩色卡纸剪贴,也很逼真。最后的细胞膜颇费了一帆周折,用保鲜膜和胶带贴好即可。
02
【方法二】
用硬纸壳做细胞壁,并在内部贴了一层纸作为细胞膜,内部的细胞器,是仿照书上做的比较粗糙,由于细胞核是圆的,不方便做,我就找了一个小薯仔,削皮后切掉1/4作为细胞核。主要设计思路是仿照书上的范例做的,由于纸卡比较硬,高尔基体和线粒体的嵴做得不是很像。
【方法三】
材料:各色彩色卡纸、白纸、青枣、橘皮(绿色)、米粒、透明塑料外壳、胶带、剪刀、胶水等。
过程:
1、用彩色卡纸做线粒体、高尔基体、内质网、类囊体。
线粒体:用红色彩纸剪一长条,围起来用胶带粘住作为外膜;再剪一长条,反复折叠后取开放在里面作为内膜。
高尔基体:用粉色彩纸剪几个长条围成几个圈粘好,用胶带将它们固定。
内质网:用蓝色彩纸剪一长条反复折叠,用胶带固定成形。
类囊体:用绿色纸片剪若干小圆片,5-18个用胶水粘合叠在一起,组成基粒。
2、叶绿体:切1/5左右的橘皮,自然卷曲成为叶绿体的形状,把做好的基粒放在其中。
3、细胞膜和细胞壁:用普通白纸折一个无盖方盒作为细胞膜,用黑色卡纸折一个更大的无盖方盒套在细胞膜外面作为细胞壁。
4、核糖体:将一些米粒粘在内质网上作为附着的核糖体,撒在细胞内一些米粒作为游离的核糖体。
5、细胞核:用一个青枣放在细胞内作为细胞核。
6、液泡:将一个塑料包装盒稍加改造作为大液泡。
还有其他等等
3. 你认为植物细胞工程制药技术由哪些方面的技术方法,阐述其技术原理与特点。
植物细胞工程制药技术由哪些方面的技术方法,其技术原理与特点如下:
1、植物细胞工程的基本技术:植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术、植物细胞的全能性。植物细胞工程指已经分化的细胞,仍具有发育成完整个体的潜能。
2、原因特点:生物体的任何一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因,从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。
植物组织培养技术
植物组织培养愈伤组织是由一团排列疏松而无规则,高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞组成。薄壁组织细胞具有潜在的细胞分裂能力,在一定的外界因素刺激下可再生,使植物的创伤愈合或形成不定根、不定芽等。
这个培养必要条件是离体、一定的营养物质、激素、其他外界条件(无菌环境、一定的温度、适合的PH、适时光照等),植物体细胞杂交定义是将不同的植物体细胞,在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
4. 制备细胞膜的方法
活动目标
1.体验用哺乳动物红细胞制备细胞膜的基本方法。
2.使用高倍显微镜观察制备细胞膜过程中细胞的变化。
背景资料
生物膜的研究发展迅速。要研究生物膜的组成、结构及功能,首先必须分离出纯净的细胞膜。分离得到的哺乳动物的红细胞膜,一般称为“血影”。哺乳动物成熟的红细胞中没有一般真核细胞所具有的细胞核和细胞器,容易用它制备纯净的细胞膜。此外,哺乳动物的血液也比较容易获得,因而是研究细胞膜的理想材料。
从哺乳动物的红细胞中分离细胞膜,第一步是将血液收集在加有抗凝剂的容器内,用低速离心的方法从血液中分离出红细胞,然后用等渗缓冲液反复洗涤,经多次离心,去除血浆。第二步是在红细胞中加入低渗缓冲液,由于低渗溶液的作用,大量水分进入细胞,使红细胞胀破而溶血。第三步是将溶血的红细胞反复而充分地高速离心、洗涤,去除血红蛋白和其他的细胞内含物,最终获得比较纯净的红细胞膜。
操作指南
1.材料 新鲜的哺乳动物血液
2.用具 离心机,离心管,滴管,显微镜,载玻片,盖玻片,吸水纸,小烧杯。
3.试剂 柠檬酸钠或肝素(抗凝剂),生理盐水(质量分数为0.9%的NaCl溶液),蒸馏水或清水。
4.操作要点
教师在实验前做以下准备工作。
准备一定量的新鲜的哺乳动物血液,如羊血或猪血,在冰箱中静置一昼夜。用滴管将上清液吸去。再吸取1 mL的沉淀物,放入离心管中,加入生理盐水2 mL,在2 000 r/min条件下离心5 min。去除上清液,在沉淀中再加入生理盐水2 mL,再离心一次,去除上清液,留沉淀备用。以上操作的目的是洗去血浆成分,避免血浆对血细胞的缓冲作用,从而使红细胞的溶血现象更加明显。
学生的实验操作如下。
(1)取一个5 mL的小烧杯,加入生理盐水2~3 mL。
(2)用滴管在沉淀的下层吸取一小滴血细胞,滴入小烧杯的生理盐水中,以达到稀释红细胞的目的,以免观察时,由于细胞密度太大,影响观察效果。
(3)取另一个滴管,在小烧杯中轻轻搅拌,然后吸取少量的血细胞稀释液,在载玻片的中央滴很小的一滴,加盖玻片。
(4)先在低倍镜下观察红细胞的正常形态,可见其边缘完整发亮。
(5)在盖玻片的一侧加一滴蒸馏水或清水,在另一侧非常小心地用吸水纸慢慢地吸引,防止把红细胞全部吸入吸水纸中而影响观察。边加水边观察,注意红细胞的形态变化。红细胞会随着水流向一侧漂移,观察时注意移动玻片。红细胞体积逐渐变大,变得非常鼓胀,在视野中可以找到少数胀破的红细胞,它们已失去完整发亮的边缘,变成弥散状。
5.需要注意的几个问题
(1)制作临时装片时,红细胞必须稀释,而且取红细胞的量要少。
(2)在高倍镜下观察,待观察清晰时,在盖玻片的一侧滴加蒸馏水,同时在另一侧用吸水纸吸引。上述操作均在载物台上进行,并随时调整镜筒高度,持续观察细胞的变化。在盖玻片一侧滴加蒸馏水的量要少,不能让盖玻片处于漂浮状态;同时在另一侧用吸水纸吸引时要小心,不要将血细胞吸走。
(3)要想取得好的观察效果,所用显微镜的放大倍数应在400倍以上。
(4)操作中要认真观察才能看到连续的变化过程。
1.分析实验原理
5. 利用细胞的培养生产天然化合物的方法分为几个步骤
植物的很多次生代谢产物(secondary:metabolism)是药物、染料、香料、色素、糖类等的重要来源,只是这些天然产物的含量太低,难以满足人类的需要,大规模人工合成又存在许多困难。
不过,在整体植物中存在的这类化合物,在培养细胞中也同样存在,随着细胞培养技术的发展,人们可以利用细胞大量培养技术来生产这些化合物。如从光下培养的胡萝卜愈伤组织能分离出紫红色、橙红色、绿色、黄白四种愈伤组织株系,其中紫红色愈伤组织能够合成大量的花青苷,而胡萝卜素含量少;中国从新疆紫草中筛选出高产细胞株系,其紫草色素含量比原植物根提高48倍,可作为轻工业原料;长春花细胞和愈伤组织培养物能合成数量较高的利血平和阿马灵。
利用细胞大量培养生产天然化合物的方法大致包括三个步骤:一是高产细胞系的建立,包括从特定的植物材料诱导愈伤组织,从愈伤组织分离单细胞,细胞诱变和突变细胞的筛选,高产单细胞无性系的保存等;
二是“种子”培养,即对高产细胞系进行多次扩大繁殖,以便获得足够的培养细胞用做大量培养时的接种材料;
三是细胞大量培养,即用发酵罐或生物反应器进行细胞培养,以生产所需的植物化合物。需要说明的是,在进行植物细胞大量培养时,不能简单地使用微生物发酵的设备和方法,必须根据植物细胞个体大、不易分散均匀、生产周期长等特点来设计生物反应器,并制定相应的操作程序。在生物反应器中,温度、pH、传导性、气体浓度、泡沫形成等是可以自动控制的。
到目前为止,通过细胞大量培养能生产的次生代谢产物包括:生物碱、类固醇、萜类化合物、醌类、生物活性物质(抗生物质、抗癌物质、抗病毒物质、酶阻害物质等)和酶类物质等。
6. 什么叫细胞式生产模式
细胞式生产方式(Cell Proction),简单说,就是自律分散型生产方式,它起源于20世纪60年代的日本。人们一般把细胞式生产方式分为:U字型生产线(流程分割生产)、单人生产货摊式巡回生产方式、无传送带生产方式、单人货摊式生产方式、一人巡回生产方式等五种生产方式。其中最典型的代表形式是“单人货摊式生产方式”,该方式主要依靠手工进行组装,由少数的精通多道工序的员工组装产品的生产方式,它是一种适应性很强的生产方式。
细胞式生产方式在实际的生产线上,根据产品的不同、环境的不同和人员的不同,其形态也有所不同。在细胞式生产方式中,每个操作者在独立的制造生产线上操作,而众多的被称为“细胞”的生产线同时进行工作,但是每一“细胞”的生产并非为所欲为和各行其是,而是有周密、严格的生产计划,一个产品在各个“细胞”中分别进行组装,最终共同完成一个成品的生产。
细胞式生产非常类似于细胞状的蜂巢中所常见的劳力分工,在制造业上的细胞式生产试图去将公司组织当中为生产产品及服务所创造出来的各式各样流程加以分类。生产计划者可能会先去对公司产品的整个范围进行调查,根据员工在工作上所需要的特殊技术,以及为生产各式产品所需要的机器类型将流程加以组合。
在某些公司里的流程分类非常清楚简洁,然而在其他公司像是这家运动用品制造商,分类的方法不见得具有持续性。基于这个原因,另外设有一个单独的“其它”类别,以便放入那些与其他分类皆不适合的产品。不过在“主细胞”当中所包含的产品,都是在其生产上对员工技术的需求及用以制造的机器类型具有类似性的产品。
每个分类细胞通常都会被当作独立的团队来管理。每个细胞中的员工所需要负责的工作有执行、排定流程以及检视。就这方面来说,细胞式生产便与由传统工作站或是生产线所执行的工作有很大的差异。在像是汽车工厂或是洗车厂所可以看到的生产线生产方式,大部分的工作都是由机器设备在做,几乎不可能有机会去发展出团队合作的精神。而在像汽车修护厂或是医院这样的工作站,员工会有根强烈的团体归属感,可是因为每个人所做的工作都不相同,几乎没有人能对整体的工作有所了解。可是在细胞式生产当中却不是这样的情况,因为每个特殊分类细胞内的员工都必须负责起全部的工作。根据细胞式生产的拥护者的说法,细胞式生产可以培育出团队的建立,对完工期的顺利达成提出挑战性,以及改进每一项产品及服务的品质
7. 哺乳动物细胞生产方式及其特点
(一)市场应对性好
标准化之后的细胞生产线可以简单复制,可以针对客户的要求随时进行专门配置;
(二)生产效率高
由高能力员工组成的细胞生产线,通过优化配置,可以实现较高的生产效率;
(三)空间利用率高
细胞生产线可以在一天内搭建完成,不需要的时候也可以简单拆除,用于其他更有价值的用途
(四)环境效益好
细胞式生产方式减少了库存、搬运等耗费,降低了物耗与能耗,可以产生较好的环境效益。
(五)有利于员工自身的全面发展
细胞式生产方式要求员工成为多面手,掌握多种工序, 成为具有综合技能的劳动者,而不像传统生产方式中那样单一的劳动者。
8. 细胞式生产方式的细胞式生产方式的基本分类
(一)无传送带生产方式
(二)U字型生产线(流程分割生产)
(三)单人货摊式生产方式(单人生产)
(四)货摊式巡回生产方式(单人生产)
(五)巡回生产方式(单人生产)
9. 细胞工程的研究对象及方法有哪些
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说,它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法,按照人们的设计蓝图,进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株,并可以产生新的物种或品系。
细胞工程(Cell engineering):
是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法,按照人们的需要和设计,在细胞水平上的遗传操作,重组细胞结构和内含物,以改变生物的结构和功能,即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法,快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。
细胞工程与基因工程一起代表着生物技术最新的发展前沿,伴随着试管植物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世,细胞工程在生命科学、农业、医药、食品、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
21世纪合成生物学的发展,采用计算机辅助设计、DNA或基因合成技术,人工设计细胞的信号传导与基因表达调控网络,乃至整个基因组与细胞的人工设计与合成,从而刷新了基因工程与细胞工程技术,并将带来生物计算机、细胞制药厂、生物炼制石油等技术与产业革命。
10. 细胞工程的种类
又称为染色体转导,或染色体介导的基因的转移。染色体转导术,目前有两类,其一,称为微细胞转移术。应用低浓度秋水仙素长时间处理可使细胞微核化,经去核处理后,可得到只含相当于几个乃至一个染色体的微细胞。微细胞被导入完整细胞以后仍显示RNA合成,因而微核编码的基因信息可望在微细胞异核体内表达出来。如小鼠的微细胞可被导入至另一品系的小鼠或仓鼠乃至人的HeLa细胞内。电泳检测显示存在着小鼠基因型的大分子物质,如脂酶D、嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶B。已知前两种酶的结构基因定位于小鼠的第14号染色体上。提示小鼠的该号染色体已进入宿主细胞内并行使其功能。
另一种方法是先诱发细胞同步分裂,继用秋水仙素阻抑细胞分裂于中期,再破碎细胞,通过离心收集大量的中期染色体。有人把此法得到的人或仓鼠的中期染色体转移到小鼠细胞内,并探查到有特异的供体基因的功能产物, 动物的染色体工程与育种
如胸苷激酶(TK)与次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。并推测整合到宿主小鼠内携带TK基因的染色体片段约大于 17000个碱基。有人证明通过染色体介导的基因转移,不仅在宿主细胞的分裂过程中能稳定地传给子代,而且还能进行连续转移,如人染色体基因可以转移到小鼠细胞内,然后再使用同样的技术从小鼠细胞转移到中国仓鼠细胞内。这些实验是在染色体水平上进行基因转移的良好开端。 在高等植物方面的染色体工程,目前还仅在六倍体普通小麦与其他种、属之间做过。六倍体普通小麦的染色体组型是由野生一粒小麦AA、小斯卑特山羊草BB和汇山羊草DD三种类型的染色体组融合而成,是一种能正常繁殖的种间杂种(AABBDD),因此,很容易容纳其他种、属染色体添加或替代。这个领域的研究目的在于改良作物品种和探究物种起源。
1.染色体的消除①单体植物,起初是利用自然发生的单倍体普通小麦制作。现在则用人工诱导花粉或未受精的子房产生的单倍体植株为材料进行。这是因为普通小麦的单倍体植株只有21条染色体,都不是成对的,因此在成熟分裂(见减数分裂)时没有联会的对象,故仍为单价染色体。这21个单价染色体能排列在赤道板上纵裂为二,在后期Ⅰ被平均分配到细胞的两极。但在第二次分裂时,这21个染色体不再纵裂,随机分开,结果产生了染色体数从0~21个的 21种类型的配子。这些配子只有具19条或20条染色体的有受精能力。因此,如果用正常植株的花 植物的染色体工程与育种
粉(n=21)给单倍体植株授粉,n=20的卵细胞以一定的比例受精,结果得到2n=41的植株。其染色体组型中有20条染色体因有同源(对应)染色体故可以配对形成二价染色体。而只有一条染色体没有配对,成为单价染色体,因此称这种类型的植物叫单体植物。例如,美国米苏里大学的E.R.西尔斯于1937~1954年共用了十七年的时间,用中国春小麦中发现的两个单倍体植物与正常花粉授粉,得到的后代中找到了 5种单体植物。其后用同样方法制作一套21种单体植物。除普通小麦外,烟草和硬粒小麦也制成了一套单体植物。②缺对植物,单体植物的体细胞染色体数为2n=41。在成熟分裂后,将形成两种配子,即n=21,n=20,这两种雌雄配子都有受精能力,而且自花授粉后也容易结实。不过两者受精率的高低有差别。因此,受精时,两种配子按一定比例进行结合。结果见表1。如果缺失型的花粉与缺失型的卵细胞结合为受精卵,由此发育成的植物,将比通常的普通小麦少一对染色体,所以叫缺对植物。E.R.西尔斯用此方法也培育出了一套普通小麦缺对植物。
2.染色体的添加①同种染色体的添加,所添加的染色体来自同种个体,添加一个的叫三体植物(2n+1);添加一对的叫四体植物(2n+2)。三体植物和单体植物一样,可得自单倍体三倍体或缺体。它的来源很多。如普通小麦单体植物在成熟分裂时,有时会出现不分离现象(即单价染色体的二个姊妹染色单体在后期Ⅰ被同时拉到同一极,而不是各自分配到两极)。结果所形成的四分孢子,其中三个的染色体数是n=20,一个是n=22。如果多一个染色体的配子与正常花粉或卵细胞 (n=21)受精后,就成为三体植物(2n=43),比原来正常普通小麦多了一个染色体。三体植物自花授粉的后代中就有四体植物出现。因为三体植物在成熟分裂时形成两种配子(n=21,n=22)。如果让三体植物自花授粉,就会出现三种类型的子代,如表2所示。其中就有新型的四体植物,比正常植物多两条染色体。②异种染色体的添加,所添加的染色体来自别种植物。以普通小麦(W)和黑麦(R)2n=14杂交为例(图1)。由于黑麦染色体不能和普通小麦配对,在成熟分裂染色体重组时,黑麦基因不能直接转移到小麦染色体上,而只能将黑麦整个染色体组加到小麦的染色体组中,所得子一代杂种为多倍单倍体(21′W7′R),仅28个染色体。经过秋水仙素处理加倍后,成为小黑麦八倍体(21″W7″R)共有56个染色体,再与小麦回交得到七倍体(21″W7′R),共49个染色体。然后与小麦再回交一次,就可得到外加的单体植物。单体植物自交后得二体植物(44个染色体21″W1″R)。另外,还有一个外加系是加入了黑麦第Ⅱ对染色体,成为44个染色体的二体植物。这种外加系能使小麦抗锈(见染色体倍性)。
3.染色体的替代用同种或异种染色体来替代某特定染色体的技术。其目的是要把已知道的具有抗病或其他有利特性的某一染色体来替代另一个具有其他性状的染色体,以改良作物品种。染色体替代有三种方法:①用普通小麦自身的染色体来替代。例如,普通小麦的一对1A染色体被一对1B染色体替代后,就能育成缺对1A、四体 1B植物,即缺对-四体植物。这种类型的植物是由缺对1A与四体1B杂交后所得子一代再自花授粉后选育而成。②普通小麦的一个品种的染色体用别的品种的染色体来替代,叫做同种染色体替代。如果用正常普通小麦B品种的花粉,与缺对的A品种杂交,所得子一代自花授粉,则在子二代就能选育出A品种的缺对的二条染色体被B品种染色体替代的植物。③用异种植物的染色体来替代,叫异种染色体替代。例如,普通小麦的2A染色体可用黑麦的2R染色体替代。为了达到这个目的,首先要育成基本材料缺对植物(2n=42-2A)和异种染色体外加系(2n=42+2R)。这样就可把普通小麦缺对2A与小麦2R染色体外加系(具有21对小麦染色体加上一对黑麦2R染色体)杂交,子一代杂种染色体2n=42,其中20对染色体是除2A外的全部普通小麦染色体,其余二个一价染色体是2A和2R,成熟分裂时可产生四种类型配子,即:n=20+2A+2R,n=20+0,n=20+2A=21,n=20+2R=21。这最后一种是具有除2A以外的20个普通小麦染色体一个黑麦的2R染色体。因此,子一代杂种自花授粉的后代中,就能得到所期望的异种染色体替代植物。即一对黑麦的2R替代了一对小麦的2A(20″W2″R)。
现在,应用染色体工程的方法,在许多添加和替代染色体工作中,已经获得了不少有遗传学和育种学价值的品系。例如,获得了添加单个冰草染色体的小麦品系中间,有的能抗粉露菌病、秆锈和叶锈。这种抗性均呈现显性单因子遗传。将黑麦第Ⅲ对染色体加到软粒小麦对粉露菌病有抗性。用冰草的一个染色体替代软粒小麦染色体3D,使软粒小麦对秆锈有抗性。这些在生产实践上都有实用价值。 诱导增加或减少一个生物体内整套染色体组数的技术。增加同种染色体组数的叫同源多倍体;增加异种染色体组数的叫异源多倍体,异源多倍体必须经过杂交才能得到(图2)(见染色体倍性)。
染色体组工程的方法:多倍体的诱发自1937年发现了用秋水仙素诱发多倍体的方法以来,一般常用药剂(秋水仙素、富民隆等),也可用高温处理来诱发多倍体。其法是把植物的种子或幼芽浸在 0.05~0.2%的秋水仙素水溶液中,处理24~96小时即可得到很好的效果。例如四倍体西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法获得的(图2)。
现在,由于原生质体分离技术的发展,也可从原生质体的融合得到多倍体。例如用聚乙二醇作诱导融合剂处理胡萝卜原生质体后,得到了频率相当高的四倍体和六倍体植株。这是来源于二个或三个原生质体融合的结果。
单倍体的诱发60年代以来,子房、花药或花粉离体培养成功,很易从大孢子、卵细胞或小孢子等得到单倍体植株。其法是将一定时期的花药或子房移植到特定的培养基上培养。待生长愈伤组织或胚状体后,再移到分化培养基上,分化出苗和根,长成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中继续栽培到开花。单倍体植物一般不能结实或仅结少量种子。
此外,还可用远缘杂交,X射线或紫外线照射,化学药品如马来酰肼、甲苯胺蓝、氯霉素等以及异源胞质等方法都能诱导单倍体产生。1970年有人又用大麦与球茎大麦杂交后染色体消除的方法,产生高频率的单倍体,有的可高达68.5%。在杂交后,球茎大麦的7个染色体就消除在胚中,留下的是大麦的7个染色体,成为单倍体的胚及小植株。经秋水仙素处理后,染色体加倍形成纯合二倍体。
染色体组工程的应用诱导多倍体在植物育种上的应用是有限度的。由于作物类型不同,对多倍性诱变反应也不同。原来的倍性水平、染色体组的结构、繁殖方式、多年生性、植株实用部位,所有这些都关系到育种的成败。最适宜用染色体加倍方法改良的作物应该具有:①染色体数目较少,②以收获营养体为主,③异花授粉,④多年生和营养繁殖的习性等条件。这些都是多倍体育种获得成功的先决条件。 研究真核细胞的核、质相互关系以及细胞器,胞质基因的转移等细胞拆合的技术,所以又叫细胞拆合工程。主要研究内容是细胞质的置换。过去在植物上置换的方法是进行连续回交。例如,为了研究柳叶菜属的细胞质遗传,曾连续回交了二十五代,结果还不能把全部母核替代出来。现在由于核移植和原生质体的分离方法的改进,推进了这项工程的进展。
细胞质工程的方法去核和核移植 动物细胞核的移植一般都用显微操作器进行。50年代初期,美国生物学家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期细胞的细胞核移植到去核的蛙卵,并能正常发育。后来,英国J.B.格登把爪蟾蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核卵内,能发育到有生殖能力的成体。中国童第周等还成功地进行金鱼类异种、异属之间的核移植实验(见细胞分化)。70年代以来,体外培养的动物细胞的去核,是先用细胞松弛素B处理细胞,再高速离心使细胞核与细胞质分开。分离出来的核,带有少量胞质并围有质膜,称为“核体”或“小型细胞”。核体能重新再生其胞质部分,继续生长、分裂。去核后的胞质部分,仍由膜所包围,即为“胞质体”或“去核细胞”(图3)。秋水仙素及其衍生物和长春新碱等也能诱发某些哺乳类细胞排核。目前制备胞质体和核体的方法目臻完善,纯度可达99%左右。胞质体约可存活18~36小时。
植物细胞核的移植,在低等植物如单细胞伞藻,可把新鲜材料的假根切下,放在玻片上用玻棒挤压,使细胞的内含物压出在一滴适合的培养液中,反复冲洗几次,然后在显微镜下观察,一直到核周围无细胞质为止。离心分离后待用。高等植物如矮牵牛、天仙子、烟草、番茄等原生质体核的分离,可先在悬浮的原生质体中用蒸馏水将悬液冲淡一半,约30分钟后,原生质体破裂,放出细胞核与叶绿体,就可在0.6M蔗糖液中离心和收集核,然后存放在一定的培养液中待用。1978年以来又借用动物细胞去核的药剂细胞松弛素B来处理原生质体,加上高速离心,使原生质体分离成二部分,即:无核原生质体和小原生质体。开辟了去植物细胞核甚至去部分染色体的新途径。
细胞重组已经分离的核体(小细胞)与胞质体在融合因子的介导下重新融合,构成“重组细胞”,这一技术即称为细胞重组,胞质体与另一完整细胞融合,即产生“胞质杂种”细胞。这两种细胞产生的效果是不同的,现在有方法把它们鉴别开。以大鼠二种成肌细胞为材料,一种是正常的具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT+)基因, 另一种是突变体缺少这种基因(HGPRT-),因此,前者细胞中有转移酶能被氚-次黄嘌呤标记,而后者没有这种酶,便不能标记。在两者的细胞质中让HGPRT+摄取小乳胶颗粒,让HGPRT-摄取大乳胶颗粒,以颗粒的大小来作标记。当核体(小型细胞)与胞质体融合后,在重组细胞中可看到核被氚-次黄嘌呤所标记,在细胞质中有大量大乳胶颗粒和极少数小乳胶颗粒。当胞质体与另一个HGPRT+完整细胞融合后的胞质杂种细胞的细胞质中,则同时出现有大量的大、小乳胶颗粒。如图4所示。应用这种方法很容易把两类细胞鉴别出来。
在植物中,原生质体与核的融合以烟草、矮牵牛的核移植为例,其步骤是:①先使矮牵牛游离核与烟草原生质体各自悬浮并沉淀在0.25M硝酸钙溶液中,pH6;②去掉上清液,再把它们悬浮起来,以适当比例使核与原生质体在试管中混合、离心,随后加入45%聚乙二醇溶液1毫升使之聚合:③30分钟后,徐徐加入4毫升0.2M硝酸钙(被pH9的甘氨酸氢氧化钠所缓冲)以诱导融合摄取核;④15分钟后加0.2M硝酸钙(pH6);⑤再过20分钟,原生质体用培养液冲洗;⑥镜检后,将具有双核的(其中一个是矮牵牛的核)烟草原生质体进行培养。
细胞质工程的应用动物方面1974年有人用两种小鼠成纤维细胞,其一用L细胞的完整细胞,它的核内具有对5-溴脱氧尿苷抗性的核基因BUd(RR),但细胞质内没有抗氯霉素的胞质基因,用的另一个细胞的线粒体上带有抗氯霉素的胞质基因CA(PR),而细胞核内带有硫代鸟嘌呤敏感核基因(TGS),把后者去核细胞与前者融合(图5),则融合后的胞质杂种细胞既能抗5-溴脱氧尿苷(BUdR),又能抗氯霉素(CAP)。但如果把亲体细胞 (BUdRR和TGS)同时培养在含有这两种药物的培养基上,则都将死去。因为这两种细胞一个对CAP敏感,另一个不抗BUdR,而胞质杂种细胞则两者都能抗,不但能存活而且还能增殖。
植物方面用等渗密度梯度高速离心后,也可得到两种亚原生质体,①在低密度范围内可得到胞质体(去核原生质体);②在高密度中,可得到小原生质体(核质体)。现在已能自玉米、烟草和胡萝卜细胞得到这两种亚原生质体。生化实验证明:去核原生质体代谢作用很低,而小原生质体由于减少了表面积和体积(仅及原生质体的10~15%),因此,摄取物质快,合成蛋白质也快,培养时发育迅速,是一种研究核质关系的好材料。由于这项工作才开始,迄今尚无明显结果。 细胞融合是指用自然或人工的方法,使两个或几个不同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞融合的结果,一个细胞中含有两个不同的细胞核,则称为异核体;随后的有丝分裂中,来自不同细胞核的染色体可能合并到一个结合核内。因此,又称为体细胞杂交。细胞融合的范围很广,从种内、种间、属间、科间一直到动、植物两界之间都进行了尝试。在植物方面,由于各类细胞具有全能性,在烟草、矮牵牛、胡萝卜等种间杂种,马铃薯和番茄、曼陀罗和颠茄、烟草和矮牵牛等属间杂种都已获得了再生植株。在动物方面人和鼠体细胞杂交,虽然不能长成一个新个体,但能作基因定位的材料。因此,这项新技术,在理论研究和工、农、医方面的应用,均有广阔的前景。细胞融合技术的发展,历史很短。自1960年在体外培养中发现杂种细胞以来,仅20多年。1965年冈田善雄等和H.哈里斯等各自用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间异核体。1970年已应用人与鼠的细胞杂交系统地进行了人类染色体基因的定位工作。在植物方面,1960年E.C.科金首先使用纤维素酶分离番茄幼根的原生质体获得成功。1970年他们又成功地使种间原生质体融合在一起。1972年P.S.卡尔森等又从融合的原生质体获得了第一株种间细胞杂种。到1980年为止,种间融合的再生植株已有16种之多。
细胞融合的方法动物细胞杂交或细胞融合 将两个不同种的亲本细胞A和B,以灭活的仙台病毒或聚乙二醇(PEG)为融合诱导剂,使A和B两细胞融合成为一个具两个遗传性不同核的异核体(如遗传性相同的核融合在一起叫同核体)。随后异核体经有丝分裂成为两个具有A和B两亲本的杂种融合核。AB杂种经多次分裂,B亲本的染色体会逐渐减少到一个或完全消失(图6)。
植物体细胞杂交①原生质体的分离。植物细胞之间有果胶质粘连,每个细胞之外还有一层纤维素组成的壁,因此,在分离原生质体时,首先要在一定浓度的酶液(果胶酶与纤维素酶)中保温,消去果胶质与纤维素后才能使原生质体分离出来。②原生质体的融合。不同种之间原生质体的融合,须选用一种融合诱导剂(聚乙二醇,或高钙CaCl2.2啹O,0.05M溶于甘露醇 0.4M和pH10.5)诱导融合。它们的诱导率可达20~50%。③杂种细胞的选择与培养。细胞融合后要把杂种细胞选择出来。一般都利用各种生化指标和遗传标记来选择和鉴定。例如,使用天然的或人工诱变的突变体,如白化苗、营养缺陷型、抗药性突变体等,或根据不同材料对激素敏感性不同,生长差异等,来设计适合的选择系统。如果融合的原生质体一个是白化,另一个具叶绿体,就可用机械的方法,把融合的细胞在倒置显微镜下把它们挑选出来进行培养。这些细胞培养到各个发育阶段,如愈伤组织、分化苗和根,都需要更换培养基,才能使它们顺利地再生成植株。