蛋白质的测定方法各有哪些优缺点

❶ 常用来测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点是什么

1、凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

3、酚试剂法

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。

缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 

缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

5、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。

在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。

缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

❷ 测定蛋白质活性的方法有哪些 细胞试验与动物实验的优缺点

定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。考马斯亮蓝法（Bradford法）。
凯氏定氮
灵敏度低，适用于0.2~
1.0mg氮，误差为
±2％
费时
8～10小时
将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）
用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（Biuret法）
灵敏度低
1～20mg
中速
20~30分钟
多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物
硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸
用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
紫外吸收法
较为灵敏
50～100mg
快速
5～10分钟
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收
各种嘌吟和嘧啶；
Folin－酚试剂法（Lowry法）
灵敏度高
～5mg
慢速
40～60分钟
双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原
硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；
各种硫醇
耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)
灵敏度最高
1～5mg
快速5～15分钟
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm
强碱性缓冲液；
SDS
最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；
颜色深浅随不同蛋白质变化

❸ 常用来测定蛋白质含量的方法有哪些，优缺点是什么

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

❹ 请问,测定蛋白质相对分子质量各方法的优缺点,谢谢测定蛋白质相对分子质量方法优缺点

用离心方法分离
和亚细胞物质的基本原理是根据它们在液体介质中或者沉降速度不同而形成不同的区带,或者它们的密度不同而停留在液体介质中不同的位置而把它们一一分开.
前者是沉降速度法,应用该法时液体介质的最大密度要小于样品中最小颗粒的密度,离心时选用高转速和短时间；后者是沉降平衡法,应用该法时液体介质的最大密度要大于样品中最小颗粒的密度,离心时选用较低转速和较长时间.
如果测蛋白质的相对分子量可用速度区带(或速度梯度)离心
本法是将样品放在一个连续的密度梯度液体上,通过离心,大分子量蛋白质沉降快,小分子量沉降慢.经过一段时间,相同分子量的蛋白质就在同一深度形成一条
,因此把各种分子量大小分开来.它适用于分离密度相同、而大小不同的物质,蛋白质组份密度都差不多,但分子量不一样,用本法很容易将其分开.但对密度不同、大小类似的物质则不易分离.
蔗糖梯度是一种常用的介质.用不同浓度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度,用于梯度离心.再分别进行收集处于不同区带里的各个组份.

❺ 测定蛋白质含量的方法 缺点

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

❻ 实验室测定蛋白质分子量的方法有哪些

测定蛋白质分子量的常用方法：

粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳、渗透压法、质谱法包括电喷雾离子化质谱技术和基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速离心法）。

1、粘度法

一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为：

8、电喷雾离子化质谱技术

电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS 测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。

优缺点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。

9、基质辅助激光解吸电离质谱技术

基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。基体的作用在于保护待测物不会因过强的激光能量导致化合物被破坏。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。

优缺点：（1）同ESI-MS 一样对样品的消耗很少；（2）随着质量分析器的不断改进、新的基质的不断发现和应用以及延迟萃取技术的使用，使得MALDI-MS 的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS；（3）MALDI-MS 单电荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；（4）MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广的。

❼ 各种蛋白互作检测方法有哪些优缺点

双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近(<100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。http://doc.bio1000.com/list-81.html 生化标记技术文档，生化标记技术文档下载，生物帮上面有介绍的。

❽ 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

❾ 蛋白质含量测定方法总结

蛋白质检测方法总结 双缩脲法: 将两分子尿素分子加热脱去一分子氨而形成的就是双缩脲 (NH2-CO-NH-CO-NH2) . 双缩脲在碱性溶液中与 CU2+结合形成紫红色络合物, 这样...

❿ 比较分光光度法测定蛋白质含量与其他几种常用蛋白质测定方法的优缺点

优点：1、测量灵敏度高，快速，方便。
2、低浓度蛋白质含量可检测。
缺点：1、容易受溶液中杂质的影响。
2 、标准曲线不易做准确。