基因结构检测方法

A. 如何用PCR方法检测基因的多样性

多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。

基因多态性的主要检测方法简述如下：
1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，���钠�问�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩云�纬ざ榷嗵�裕�贾孪拗破�纬ざ确⑸�谋涞拿盖形坏悖�殖莆�嗵�晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。

2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。

3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。

4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。

5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。

6. PCR-荧光法：用荧光标记PCR引物的5’端，荧光染料FAM和JOE呈绿色荧光，TAMRA呈红色荧光，COUM 呈兰色荧光，不同荧光标记的多种引物同时参加反应，PCR扩增待检测的DNA，合成的产物分别带有引物5’端的染料，很容易发现目的基因存在与否。

7. PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法，由于PCR技术的应用，使得DNA 测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCR直接测序。PCR产物在自动测序仪上电泳后测序。常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法;Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA测序的自动化。目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法。

8. PCR指纹图法（PCR-fingerprints）：实用于快速的同种异型DR/Dw配型。在DR/DW纯合子及杂合子个体中，每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异，由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同。因此，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它们的迁移率各不相同，从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作为探针，同经过酶切的人体DNA作Southern blot，可以得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性，除非同卵双生，几乎没有两个人是完全相同的，就象人的 指纹一样，人们把这种杂交带图形称为基因指纹(gene finger-printing)。

9. 基因芯片法：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单碱基多态性，为分析SNPs提供了便捷的方法。

10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法
AFLP技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。

11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法
变性梯度凝胶电泳法（） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。
12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD( Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

B. 基因检测包括哪些项目

1.生化检测：通过化学手段，检测血液、尿液、羊水或羊膜细胞样本，检查相关蛋白质或物质是否存在，确定是否存在基因缺陷。用于诊断某种基因缺陷，这种缺陷是因某种维持身体正常功能的蛋白质不均衡导致的，通常是检测测试蛋白质含量。还可用于诊断苯丙酮尿症等。

2.染色体分析：染色体分析直接检测染色体数目及结构的异常，而不是检查某条染色体上某个基因的突变或异常。通常用来诊断胎儿的异常。

3.DNA分析：DNA分析主要用于识别单个基因异常引发的遗传性疾病，如亨廷顿病等。DNA分析的细胞来自血液或胎儿细胞。

(2)基因结构检测方法扩展阅读

基因检测可以分为以下五类：

1.基因筛检：主要是针对特定团体或全体人群进行检测。大多数通过产前或新生儿的基因检测以达到筛检的目的。

2.生殖性基因检测：在进行体外人工授精阶段可运用，筛检出胚胎是否带有基因变异，避免胎儿患有遗传性疾病。

3.诊断性检测：多数用来协助临床用药指导。

4.基因携带检测：基因携带者如果与某些特殊基因相结合，可能会导致下一代患基因疾病，通过基因携带者的检测可筛检出此种可能，作为基因携带者婚前检查、生育时的参考。

5.症状出现前的检测：检测目的是了解目前健康良好者是否带有某种突变基因，而此基因与特定疾病的发生有密切的联系。

C. 如何进行基因检测

研究表明，转录因子（TF）对调节与维持细胞状态有重要作用，且是细胞编码重组的关键因素，因此可用来解释由细胞功能或活性丧失导致的疾病病因。在现阶段，研究由各种转录因子介导的染色体内及染色体间相互作用位点或染色质修饰复合物等方面的生物技术正在飞速发展，典型的方法包括ChIA-PET（配对末端标签测序分析染色质相互作用），3C（染色体构象捕获技术），4C（环形染色体构象捕获技术），5C（复制染色体捕获技术）等，这些技术都用于探究三维空间相近但实际位点相隔较远的成对基因座。另外，较新的Hi-C技术能准确地识别染色体的相互作用，但不能鉴别使染色体呈环的因子。 另外，全基因组关联研究（GWAS）试图证明SNPs（单核苷酸多态性）普遍存在于疾病基因组中。最近来自ENCODE数据集的一项重要发现表明大多数与人类疾病有关的SNPs分布于或靠近ENCODE所标明的区域，这些区域位于基因蛋白编码区的外围。研究还发现这些与表型相关的SNPs往往分布于与转录因子结合的核小体松散区域（核小体由DNA和组蛋白构成，是染色体的基本结构单位）。 相信结合GWAS分析、组蛋白修饰和转录基因的ChIP-seq等技术，全面绘出染色体相互作用的图谱，将会给人类疾病研究带来新的契机。 说明： ChIA-PET技术是利用PET测序技术研究免疫沉淀后邻近式连接的DNA 片段，以得到染色质相互作用的技术，PET测序技术的原理是打断基因成小片段，为片段末端添加接头，再高通量测序，对比参照基因组，以定位测序的DNA片段。局限性是只能检测依赖蛋白质因子的染色质相互作用。 3C技术是甲醛固定细胞后，DNA或蛋白间的连接体也同时固定，用一种限制酶完全切割片段，再连接酶连接、拆分交联体，最后进行PCR测序。 4C技术是已知一段与其他DNA作用结合的钓鱼序列；在3C基础上多了DNA环化和反向PCR的过程。 5C技术是在构建3C库的基础上，利用通用引物进行多连接介导的PCR扩增测序。

D. 基因检测方法有哪些

基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，分析它所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的一种方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。
基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。
一般有三种基因检测方法：生化检测、染色体分析和DNA分析。
1.生化检测
生化检测是通过化学手段，检测血液、尿液、羊水或羊膜细胞样本，检查相关蛋白质或物质是否存在，确定是否存在基因缺陷。用于诊断某种基因缺陷，这种缺陷是因某种维持身体正常功能的蛋白质不均衡导致的，通常是检测测试蛋白质含量。还可用于诊断苯丙酮尿症等。
2.染色体分析
染色体分析直接检测染色体数目及结构的异常，而不是检查某条染色体上某个基因的突变或异常。通常用来诊断胎儿的异常。
常见的染色体异常是多一条染色体，检测用的细胞来自血液样本，若是胎儿，则通过羊膜穿刺或绒毛膜绒毛取样获得细胞。将之染色，让染色体凸显出来，然后用高倍显微镜观察是否有异常。
3.DNA分析
DNA分析主要用于识别单个基因异常引发的遗传性疾病，如亨廷顿病等。DNA分析的细胞来自血液或胎儿细胞。
基因检测可以分为以下五类：
1.基因筛检
主要是针对特定团体或全体人群进行检测。大多数通过产前或新生儿的基因检测以达到筛检的目的。
2.生殖性基因检测
在进行体外人工授精阶段可运用，筛检出胚胎是否带有基因变异，避免胎儿患有遗传性疾病。
3.诊断性检测
多数用来协助临床用药指导。
4.基因携带检测
基因携带者如果与某些特殊基因相结合，可能会导致下一代患基因疾病，通过基因携带者的检测可筛检出此种可能，作为基因携带者婚前检查、生育时的参考。
5.症状出现前的检测
检测目的是了解健康良好者是否带有某种突变基因，而此基因与特定疾病的发生有密切的联系。
临床意义
1.用于疾病的诊断
如对结核杆菌感染的诊断，以前主要依靠痰、粪便或血液培养，整个检验流程需要在两周以上，采用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在短时间内就能得到结果。
2.了解自身是否有家族性疾病的致病基因，预测患病风险
资料证实10%～15%的癌症与遗传有关，糖尿病、心脑血管疾病等多种疾病都与遗传因素有关。如具有癌症或多基因遗传病（如老年痴呆、高血压、糖尿病等）的人可找出致病的遗传基因，就能够有针对性地调整生活方式，预防或者延缓疾病的发生。
3.正确选择药物，避免滥用药物和药物不良反应
由于个体遗传基因上的差异，不同的人对外来物质产生的反应也会有所不同，因此部分患者使用正常剂量的药物时，可能会出现药物过敏、红肿发疹的现象。根据基因检测的结果，可制定特定的治疗方案，从而科学地指导使用药物，避免药物毒副反应。

E. DNA基因识别技术

当人类基因组研究进入一个系统测序阶段时，急需可靠自动的基因组序列注释方法和技术，以处理大量已测定的但未知功能或未经注释的DNA序列，例如，将序列分为基因、启动子、转录调控区等。基因组注释的一个首要问题是找出所有的基因。对于基因组DNA序列中的基因识别方法，人们已研究了近二十年，这是生物信息学领域里的一个重要研究内容。由于DNA测序技术的迅速发展，我们已经得到一些完整的基因组序列，有效地解决基因识别问题显得越来越迫切。基因识别中的一个关键问题是预测编码区域。所谓编码区域预测，一般是指预测DNA序列中编码蛋白质的部分，即基因的外显子部分。而基因识别的最终目标是预测完整的基因结构，正确地识别出一个基因的所有外显子及其边界。

识别DNA序列中蛋白质编码区域的方法主要有两类。一类是基于特征信号的识别。真核基因外显子（编码区域）具有一些特别的序列信号，如内部的外显子被剪切接受体位点和给体位点所界定，5’-端的外显子一定是在核心启动子（Core Promoter，例如TATA盒）的下游，而3’-端的外显子的下游包含多聚A信号和终止编码。根据这些序列特征信号确定外显子的边界，从而达到识别编码区域的目的。 然而没有一个算法在预测基因时仅仅检测这些信号，因为这些信号的强度太弱，它们缺乏统计的显着性。另一类是基于统计度量的方法，对编码区进行统计特性分析。通过统计而获得的经验说明，DNA中密码子的使用频率不是平均分布的，某些密码子会以较高的频率使用，而另一些则较少使用。这样就使得编码区的序列呈现出可察觉的统计特异性，即“密码子偏好性（codon biases）”。利用这一特性对未知序列进行统计学分析可以发现编码区的粗略位置。统计度量方法主要包括：密码子使用倾向（codon usage)、双联密码统计度量（dicodon statistic measure）、核苷酸周期性分析（即分析同一个核苷酸在3,6,9,…位置上周期性出现的规律）、基因组中等值区（isochore）的分析等。

最初基因分析方法是进行简单的核苷酸统计，而后加上剪切保守位点的检测。以后采用了人工神经网络、隐马尔柯夫模型等先进的信息处理和分析技术，并与同源序列搜索结合起来，通过与已知基因序列或者EST序列的比较，提高基因识别的准确率。基因识别方法又可以分成两大类，即从头算方法（或基于统计的方法）和基于同源序列比较的方法。从头算方法根据蛋白质编码基因的一般性质和特征进行识别，通过统计值区分外显子、内含子及基因间区域。基于同源的方法利用数据库中现有与基因有关的信息（如EST序列、蛋白质序列），通过同源比较，帮助发现新基因。对于新的DNA序列，搜索与已知蛋白质、EST相似的区域，发现编码区域。最理想的方法是综合两大类方法的优点，开发混合算法。常见的编码区分析工具通常将多种技术组合起来，给出对编码区的综合判别，如利用下文介绍的神经网络方法等。

5.5.1 最长ORFs法

对于任何给定的核酸序列（单链DNA或mRNA），根据密码子的起始位置，可以按照三种方式进行解释。例如，对于序列ATTCGATCGCAA，一种可能的密码子阅读顺序为ATT、CGA、TCG、CAA，另外两种可能的密码子阅读顺序分别为A、TTC、GAT、CGC、AA和AT、TCG、ATC、GCA、A。这三种阅读顺序称为阅读框（reading frames）。一个开放阅读框（ORF, open reading frame）是一个没有终止编码的密码子序列。

可以用最长ORFs法识别原核基因。原核基因结构相对比较简单，其基因识别任务的重点是识别开放阅读框，或者说是识别长的编码区域。辨别序列是编码区域或是非编码区域的一种方法是检查终止密码子的出现频率。由于一共有64个密码子，其中3个是终止密码子，因此，如果一条核酸序列是均匀随机分布的，那么终止密码子出现的期望次数为每21（»64/3）个密码子出现一次终止密码子。每个编码区域只存在一个终止密码子，该密码子作为编码区域的结束标志。因此，如果能够找到一个比较长的序列，其相应的密码子序列不含终止密码子，那么这段序列可能就是编码区域。在实现基于上述思想的算法时，扫描给定的DNA序列，在三个不同的阅读框中寻找较长的ORF；当遇到终止密码子以后，回头寻找起始密码子，以确定完整的编码区域。

大部分早期的DNA序列数据来自于线粒体或细菌基因组，最早的基因识别方法就是针对这类序列数据而发展起来的。一个简单的算法，如果它能够发现较长的ORF，并使用长度阈值（例如300bp），则该算法将检测到大多数基因，并且具有很好的特异性。当然，这种算法比较简单，不适合处理短的ORF或者交叠的ORF。

5.5.2 基于密码子出现频率的预测方法

真核基因远比原核基因复杂，一方面，真核基因的编码区域是非连续的，编码区域被分割为若干个小片段。另一方面，真核基因具有更加丰富的基因调控信息，这些信息主要分布在基因上游区域。为了确定基因在一段序列上所处的位置，需要首先找出基因两端的功能区域，即转录启动区和终止区，然后在启动区下游位置寻找翻译起始密码子，从而确定基因起始位置。为了取出外显子，而将内含子剔除，必须识别转录剪切位点，即剪切给体位点和剪切接受体位点。

必须清楚，要想设计一个100%识别编码区域的程序几乎是不可能的。问题是如何提高一个识别算法的敏感性Sn和特异性Sp。Sn 和Sp都应该比较高，若一个算法的测试结果仅仅一个很高，而另一个很低，则该算法是不成功的。例如，假设有一个识别编码区域的算法，它将所有介于AG和GT之间的序列片段都找出来作为识别结果，那么该算法的敏感性Sn将达到100%，但其特异性Sp却近似于0%。因此，对于一个识别算法，往往用敏感性和特异性的平均值作为衡量其准确率的指数，即(Sn+Sp)/2。在一般情况下，调整程序的参数，使得Sn»Sp。

真核DNA序列中基因的识别是一个复杂的问题，一种方法是首先通过统计分析预测编码区域，挑选出候选的外显子，然后利用动态规划方法构造最优的基因结构，这个最优的基因结构被定义为一个外显子一致的链。然而，直接运用这种方法会遇到概念上和计算上的困难。每一个候选的基因由许多统计参数来刻画，但还不清楚如何将这些统计参数组合到一个打分函数中。这个问题在一定程度上可以用神经网络来解决，运用神经网络为每个候选的外显子打分，或将神经网络与动态规划相结合，从而构造最优基因结构。然而使用标准的动态规划隐含说明仅仅考虑具有加和性的打分，而许多序列分析表明用非线性的函数有时会得到更好的效果。矢量动态规划方法为利用非线性函数提供了可能。矢量动态规划构造一组基因，并确保其中包含满足自然单调条件的函数所对应的最优基因。

这里首先介绍一种根据各个密码子出现频率识别编码区域的方法。例如，亮氨酸、丙氨酸、色氨酸分别有6个、4个和1个密码子，将一个随机均匀分布的DNA序列翻译成氨基酸序列，则在氨基酸序列中上述3种氨基酸出现的比例应该为6:4:1。但是，在真实的氨基酸序列中，上述比例并不正确。这说明DNA的编码区域并非随机序列。

假设在一条DNA序列中已经找到所有的ORF，那么，可以利用密码子频率进一步区分编码ORF和非编码ORF。将每个ORF转换为相应的密码子序列，得到一个64个状态的马尔柯夫链。这里，为每个密码子分配一个状态，状态转换概率即为一个密码子跟随在其他密码子后面的概率。利用这种方法，可以计算一个ORF成为编码区域的可能性。

在识别编码区域的马尔柯夫链模型中，一个密码子出现的概率依赖于其前面一个密码子。下面考虑另一个简单的统计模型，在该模型中，假设相继的密码子是独立的，不存在前后依赖关系。令fabc代表密码子abc在编码区域出现的频率。给定一个不知道阅读框的编码序列a1,b1,c1, a2,b2,c2,…, an+1,bn+1, 对于从密码子a1b1c1开始的阅读框，其n个密码子的出现概率为

同样，在第二种和第三种阅读框中，n个密码子出现的概率分别如下

令Pi代表第i个阅读框成为编码阅读框的概率，其值按下列公式计算：

在设计算法时，在给定的核酸序列上移动一个长度为n的窗口，对窗口内的每个序列片段按上式计算Pi，并根据Pi的值识别编码的阅读框。软件包CGC中的Codon Preference程序采用的就是这种方法。

可以将密码子使用偏性作为编码区域的一种统计特性。对现有的大量序列数据进行分析，不难发现：外显子和内含子在密码子的出现上存在着明显的差异。

在一个基因中，第i个（i=1，64）密码子相对使用倾向RSCUi的定义如下：

其中Obsi是该基因中第i个密码子实际出现的次数，而Expi是对应密码子期望的出现次数。

åaai是统计的第i个密码子出现的次数，åsyni是所有与第i个密码子同义密码子出现的次数。RSCU值大于1表示相应密码子出现的次数比期望次数高，而小于1则表示出现次数相对较少。

实验说明，连续的6个核苷酸出现频率的对比是预测一个窗口是否属于编码区域或非编码区域的最好的单个指标。若编码窗口的长度至少为50 bp，则最好的编码预测准确率约为70%。假设一段DNA序列为S，从S的第i位到第j位的双联密码统计度量IF6（i，j）定义为：

其中，fk是从第k位开始的双联密码的频率，Fk是该双联密码随机出现的频率。这里假设j的取值为大于等于6。

此外，利用密码子第三位的偏性，也可以预测编码区域。这种方法的准确率取决于对已知基因的统计，统计样本数必须足够多。

利用各种统计编码度量，可以预测一段DNA序列是否是编码区域。许多编码区域识别算法都是基于这种思想的。

分析实例：

F. 检测基因表达的方法

主要用探针检测mRNA或用抗体检测出表达的蛋白质(转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测)

一、外源基因转录水平的鉴定

基因表达分为转录及翻译两阶段，转录是以DNA（基因）为模板生成mRNA的过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白质的过程，检测外源基因的表达就是检测特异mRNA及特异蛋白质的生成。所以基因表达检测分为两个水平。

即转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测。转录水平上的检测主要方法是Northern杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测RNA链。和Southern杂交相同，Northern杂交包括斑点杂交和印迹杂交。

也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方法检测外源DNA在植物体内的转录表达。其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录，然后再经PCR扩增。

如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录。此法简单、快速，但对外源基因转录的最后决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。

二、外源基因表达蛋白的检测

表达蛋白的检测方法有三种：

1、生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；

2、免疫学检测法：通过目的蛋白（抗原）与其抗体的特异性结合进行检测，具体方法有Western杂交、酶联免疫吸附法（ELISA）及免疫沉淀法；

3、生物学活性的检测。

Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离抗原（Antigen）固定在固体支持物上（如硝酸纤维素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不同，据此可确定特定的抗原存在与否以及相对丰度，或者蛋白质是否遭到降解等。

蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，温育，以封闭非特异性位点，然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体杂交，抗原-抗体结合，再通过放射性自显影或显色观察。

(6)基因结构检测方法扩展阅读

外显子与内含子表达过程中的相对性 从内含子与外显子的定义来看，两者是不能混淆的，但是真核生物的外显子也并非都“显”（编码氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外显子完全“不显”之外，几乎全部的结构基因的首尾两外显子都只有部分核苷酸顺序编码氨基酸，还有完全不编码基酸的外显子，如人类G6PD基因的第一外显子核苷酸顺序。

已发现一个基因的外显子可以是另一基因的内含子，所这亦然。以小鼠的淀粉酶基因为例，来源于肝的与来源于唾液腺的是同一基因。淀粉酶基因包括4个外显子，肝生成的淀粉酶不保留外显子1，而唾液腺中的淀粉酶则保留了外显子1的50bp顺序，但把外显子2与前后两段内含子一起剪切掉，经过这样剪接，外显子2就变成唾液淀粉酶基因中的内含子。

同一基因在不同组织能生成不同的基因产物来源于不同组织的类似蛋白，可以由同一基因编码产生，这种现象首先是由于基因中的增强子等有组织特异性，它能与不同组织中的组织特异因子结合，故在不同组织中同一基因会产生不同的转录物与转录后加工作用。

此外真核生物基因可有一个以一的poly(A)位点，因此能在不同的细胞中产生具有不同3’末端的前mRNA，从而会有不同的剪接方式。由于大多数真核生物基因的转录物是先加poly(A)尾巴，然后再行剪接，因此不同组织、细胞中会有不同的因子干预多聚腺苷酸化作用，最后影响剪接模式。

G. 在dna水平上分析基因一级结构，拷贝数变化及在染色体上位置可以采用哪些方法

基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列测序，解析一级结构最精确的技术就是DNA测序，第一代测序技术为Sanger测序法（双脱氧测序法）,第二代测速技术是循环芯片测序技术，第三代测序技术是单分子测序技术；分析某种基因的种类及拷贝数，实质上就是对基因进行定性和定量分析，常用的技术包括DNA印迹技术（Southern印记）和实时定量PCR技术；基因在染色体上位置的检测可以通过荧光分子标记法。
该答案由本人查阅资料整理归纳，如有异议，欢迎批评指正。

H. 基因检测准确率多少

基因检测的准确率还是很高的。

基因检测主要是利用分子生物学技术检测DNA、RNA的结构以及基因表达水平是否有变化，对基因作出诊断。基因检测在遗传性疾病中有重要的作用，可以检测特定的基因突变来确定患有某种遗传性疾病。另外基因诊断在肿瘤中也有重要的诊断价值，对诊断肺癌，乳腺癌以及大肠癌起到早期诊断的作用，还可以对肿瘤进行临床分期，预测愈后，肿瘤高危人群的筛查，指导个体化治疗和预防。基因检测方法大致分为三种：生化检测是通过生物化学分析，检测血液、尿液、羊水或羊膜细胞样本，检查目标基因相关蛋白质或物质是否存在，确定是否存在基因缺陷；检测染色体数目及结构的异常，通常用来诊断胎儿的异常；DNA分析主要用于识别单个基因异常引发的遗传性疾病，如亨廷顿病（Huntington’s disease,HD）等，DNA分析的细胞来自血液或胎儿细胞。

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I. 检测某一生物的基因型的方法

表现型相同：基因型不一定相同。
基因型相同：
环境相同，表现型相同。
环境不同，表现型不一定相同。
更仔细参阅：
基因型又称遗传型，
它反映生物体的遗传构成，即从双亲获得的全部基因的总和。据估计，人类的结构基因约有5万对。因此，整个生物的基因型是无法表示的,遗传学中具体使用的基因型，往往是指某一性状的基因型，如白化病的基因型是cc，它只是表示这一对等位基因不能产生酷氨酸酶。所以基因型是从亲代获得的，可能发育为某种性状的遗传基础。表现型是指生物体所有性状的总和。但整个生物体的表现型是无法具体表示的。因此,实际使用的表现型,往往也是指生物发育的某一具体性状。如体内不能产生酪氨酸酶等。表现型是生物体把遗传下来的某一性状发育的可能变成现实的表现。
基因型、表现与环境之间的关系
基因型、表现与环境之间的关系，可用如下公式来表示：表现型＝基因型＋环境
现以人类的优生为例,优生是生育在智力和体质方面具有优良表现型的个体,而表现型的优与劣是由基因型（遗传）与环境共同决定的。当然在中不同性状的发育与表现中，两者的相对重要性是不同的。人们可以应用这个关系的原理来防治遗传病,如苯丙酮尿症是常染色体隐性遗传病,它是由一对隐性致病基因决定发病的，这个环境条件是体内有过量的苯丙氨酸。假若在食物中控制苯丙氨酸，食用含苯丙氨酸的量对人体来说是最低维持量的食品，致病的基因型就不能起作用，这时的表现型就可以是正常的，所以临床上可以通过食物疗法来治疗苯丙酮尿症。优境学就是利用环境条件，使优良的基因型（遗传基础）得到充分的表现，使不良基因型的表现型得到改善。
人类的疾病几乎都与遗传有关，也都受环境的影响，只是不同的疾病受环境与遗传两个因素影响的程度不同，某些疾病明显地受遗传支配，而另一些疾病则受环境的显着作用。

J. 基因检测方法有好几种，哪一种方式比较好

需要按照实际需求去选择，没有哪个最好的说法，合适的就是最好的
常用基因诊断技术：
一、Southern印迹法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。
当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。

二、聚合酶链反应

近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。

三、扩增片段长度多态性

小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.

四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法

当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.

PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。

五、单链构象多态性诊断法

单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。