蛋白活性检测方法

A. 一般采用什么方法检验蛋白质即鉴定

一般用双缩脲试剂鉴定，双缩脲试剂可以和蛋白质发生紫色反应。

B. 如何测定蛋白活性

根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。
除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为16％，细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50％一80％，一般以65％为代表，有些细菌则只占13％一14％，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：
蛋白质总量＝含氮量×6.25
核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×`10^(-5)`NG。因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA，求得DNA含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。

C. 测定血清总蛋白的参考方法是

总蛋白的六种检测方法
（一）凯氏定氮法
将血清与强酸一起加热消化，使血清中的含氮化合物转化为铵盐，再加碱使铵盐成为氨进经蒸馏分离出来，最后用酸滴定测定氮量，按每克氨相当于6.25g蛋白质计算蛋白质的浓度。
应用历史较久，结果较准确，是蛋白质测定的参考方法，但操作复杂，影响因素较多，且不少蛋白质的含氮量并非16%，不适用于日常工作，目前多用于标准蛋白的标定及校正其它的常规方法。
（二）双缩脲法
蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色复合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质含量成正比。
此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）与碱性铜溶液作用形成紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。几分子中含有两个甲酰胺基(-CO-NH2)的化合物都能出现此反应。
因至少含2个-CONH-基团才能与Cu2+络合，所以氨基酸和二肽无此反应。体液中小分子肽含量极低，故血浆中除蛋白质外几乎不存在可与双缩脲试剂显色的物质，且各种蛋白质显色程度基本相同。
此法简便、准确、重复性好，在10-120g／L。浓度范围内呈良好的线性关系，批内CV值<2％，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。
（三）酚试剂法
蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物。Lowry改良法在酚试剂中加入Cu2+，提高了呈色的灵敏度，其中75％呈色靠铜离子产生。Lowry改良法的灵敏度为双缩脲法的100倍左右。
由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的比例不同，如白蛋白含色氨酸为0.2％，而在一些球蛋白中色氨酸含量高达2％~3％，因此使用本法测定纯粹的、单一的蛋白质较合适。此法灵敏度较高，为10~60ug／ml，因而适用于测定蛋白质含量较少的标本(如脑脊液)，但试剂反应易受还原性化合物糖类、酚类及多种药物如水杨酸、氯丙嗪和某些磺胺药的干扰。
（四）紫外分光光度法
蛋白质分子内的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm波长处有一吸收峰，依此性质可用于蛋白质定量。
由于各种蛋白质中芳香族氨基酸的含量和比例不同，血清中游离的酪氨酸和色氨酸在280nm处也有吸收，因尿酸和胆红素在280nm处也有干扰，因而本法的准确性和特异性都受到很大的影响。
此法敏感而且简便，由于制剂未经任何处理，蛋白质的生物活性得以保留，故常用于较纯的酶和免疫球蛋白的测定。但此法需紫外分光光度计和石英比色杯。
（五）染料结合法
在酸性环境中，蛋白质分子解离出的-NH3+，可与染料的阴离子产生颜色反应。常用的染料有氨基黑、考马斯亮蓝等。这一性质可用于电泳后蛋白质的染色和血清总蛋白测定。
此法操作简便、重复性好、灵敏度高、且干扰因素较少。缺点是特异性不高，分子量3 000以上的多肽也参与反应。另外，不同蛋白质和染料的结合力不一致，因此很难找到一种合适的物质作标准物，使此方法的应用受到限制。
（六）比浊法
用某些酸类(如二氯醋酸、磺基水杨酸等)和血清蛋白质结合产生沉淀，然后测定其浊度，与同样处理的蛋白标准液比较，即可求得蛋白质含量。
此方法简便，不需特殊仪器。缺点是浊度形成的强弱易受多种因素影响，如加入试剂的方法、反应时的温度等。另外，蛋白质沉淀时易形成絮状物，难以获得稳定的悬浮液

D. 蛋白浓度测定的方法具体有哪些

蛋白浓度测定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作简单且易回收。蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。

2. 双缩脲法

利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。

蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。

但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。

3. Folin-酚试剂法

目前实验室较多用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。其原理是蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。

4. 考马氏亮蓝G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

以上便是实验室中常见的几种蛋白浓度测定的方法，另外还有凯氏定氮法和BCA法，有凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎。

E. 免疫球蛋白的检测方法

异常血清免疫球蛋白检测方法学探讨（vip资料）
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保健食品检验方法－－ig检验
sfda网站和保健食品相关网站上都可以检索到。

关于牛初乳及其制品中免疫球蛋白G的检测方法

溶液配制：

1） 缓冲液A： 0.05mol.L-1磷酸二氢钠溶液（pH6.5）；

2） 缓冲液B: 0.05mol.L-1甘氨酸溶液（pH2.5）；

3）IgG贮液：sigma公司IgG配成浓度约4mg.mL-1溶液，冷冻浓缩至200mL。

样品制备和检测：取一定量牛初乳粉，溶解于缓冲液A，制成浓度2mg/mL的溶液，用0.45mm微滤器过滤后进样。按下表方案使用缓冲液B梯度洗脱。控制不同进样体积（25~200mL）产生标准响应曲线（5mg到70mg）。IgG贮液用缓冲液A稀释后，制成IgG标准曲线（4~40mg）。通过280nm处吸收值监测洗脱液蛋白浓度。

表1 蛋白质G亲合HPLC的梯度洗脱条件

时间（min） 流速（ml/min） %A %B 梯度
0 1.0 100 0 -
0.5 1.0 100 0 -
1.0 2.0 100 0 线性
1.5 2.0 0 100 -
4.0 2.0 0 100 线性
5.0 1.0 100 0 -
7.0 1.0 100 0 -

具体操作可参阅国标GB/T 5009.194- 2003和曹劲松《初乳功能性食品》第10章。

3、 RID与HPLC的比较

一般地，HPLC检测结果将高于RID检测结果。

我们实验室对比研究了牛初乳IgG抗原决定簇部位（或第二抗体结合部位）和蛋白质G结合部位的变性动力学，证实：在实验温度（69℃~81℃）范围内，IgG分子上蛋白质G结合部位在热处理过程中更为耐热，或者说IgG抗原决定簇部位相对更为热敏感。从而，揭示了上述现象的本质：RID测到的IgG在整体变性程度上低于HPLC测到的IgG。因此，国外一些将RID和ELISA方法测定的IgG含量视为“免疫活性IgG”是比较科学的。

在各温度下IgG分子上蛋白质G结合部位变性反应各温度下的D值均比IgG分子上第二抗体结合部位变性反应的相应温度下的D值大，说明IgG分子上蛋白质G结合部位在热处理过程中要比IgG抗原决定簇部位更为耐热。该温度范围内IgG分子上抗原决定簇部位热变性活化能（270.55kJ/moL）大大低于IgG分子上蛋白质G结合部位热变性活化能（316.42kJ/moL）。在该温度范围内IgG分子上第二抗体结合部位变性反应的Z值为9.34℃，IgG分子上蛋白质G结合部位变性反应的Z值为7.25℃，可认为：IgG分子上第二抗体结合部位的稳定性在上述温度范围内相对恒定，而蛋白质G结合部位的稳定性相对容易随温度发生变化。在酸性乳清溶液中，也获得类似的研究结论。
上述研究结果即将发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》和《Journal of Food Science》。

4、其它

随着未来技术的发展，并不排除其它可能的IgG检测方法。例如ELISA法，国内已经建立，而且有国外公司可提供试剂盒。

F. 测定碱性蛋白酶活有哪些方法

碱性蛋白酶酶活力检测方法

酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。

碱性蛋白酶酶活测定原理 福林法原理

碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（Folin)（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力，以此计算其酶活力。

酶活力测定实验步骤

酶液制备：精确称取干酶粉1g（±0.001），加入10mL缓冲液（2.2.5），在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静置片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲液定容至刻度，充分摇匀，用四层纱布过滤。吸取滤液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液位稀释2000倍的酶液。（稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活）

酶活定义

碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位。

酶活力测定注意事项

1、酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响，因此必须严格控制。

2、用三氯醋酸终止反应后，过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。

3、因为Folin试剂对酸性环境比较敏感，容易发生变化，因此在测定时有顺序的规定，需要先加入碳酸钠溶液形成一个碱性环境，之后再加入Folin试剂，使其能正常发挥作用

G. 求助：蛋白酶酶活的测定方法

酶活测定方法 还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。
色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法
常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法
将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

H. 确定血清白蛋白纯度和生物活性鉴定方法 并且确定所用试剂仪器，急求，谢谢

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、 标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所 测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、 蛋白质含量测定方法 1、 凯氏定氮法 2、 双缩脲法 3、 Folin-酚试剂法 4、 紫外吸收法 5、 考马斯亮蓝法 三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍 蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—2 50,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、 标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15 mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作， 测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太 大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、 玻璃仪器要洗涤干净。 2、 取量要准确。 3、 玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

I. 蛋白药物生物学活性检测方法有哪些

一、MTT比色法检测细胞活性
（一）原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
（二）试剂准备
1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。
2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。
3、MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。
5、L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。
6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃ 5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。