临床检测结核杆菌的耐药谱的方法

‘壹’ 肺结核的诊断方法有哪些

1．病史和症状体征

（1）症状体征情况：肺结核患者的症状一般没有特异性，但明确症状的发展过程对结核病诊断有重要参考意义。体征对肺结核的诊断意义有限。

（2）诊断治疗过程：确定患者是新发现还是已发现病例。不少肺结核患者首次就诊多在综合医院，且接受治疗，应记录首次诊断情况特别是痰排菌情况、用药品种、用药量和时间、坚持规律用药情况等，这对将来确定治疗方案有重要价值。如果是复发患者，治疗史对判断耐药情况有参考意义。

（3）肺结核接触史：主要是家庭内部接触史，对邻居、同事、宿舍等有无肺结核患者也应了解。记录接触患者的病情、排菌情况、治疗方案和用药规律情况、接触时间、接触密切程度等。

2．影像学诊断

胸部X 线检查是诊断肺结核的重要方法，可以发现早期轻微的结核病变，确定病变范围、部位、形态、密度、与周围组织的关系、病变阴影的伴随影像；判断病变性质、有无活动性、有无空洞、空洞大小和洞壁特点等。肺结核病影像特点是病变多发生在上叶的尖后段和下叶的背段，密度不均匀、边缘较清楚和变化较慢，易形成空洞和播散病灶。诊断最常用的摄影方法是正、侧位胸片，常能将心影、肺门、血管、纵隔等遮掩的病变以及中叶和舌叶的病变显示清晰。

CT 能提供横断面的图像，减少重叠影像，易发现隐蔽的病变而减少微小病变的漏诊；比普通胸片更早期显示微小的粟粒结节；能清晰显示各型肺结核病变特点和性质，与支气管关系，有无空洞，以及进展恶化和吸收好转的变化；能准确显示纵隔淋巴结有无肿大。

常用于对肺结核的诊断以及与其他胸部疾病的鉴别诊断，也可用于引导穿刺、引流和介入性治疗等。

3．痰结核分枝杆菌检查

确诊肺结核病的主要方法，也是制订化疗方案和考核治疗效果的主要依据。每一个有肺结核可疑症状或肺部有异常阴影的患者都必须查痰。

（1）痰标本的收集：肺结核患者的排菌具有间断性和不均匀性的特点，传染性患者查一次痰也许查不出，所以要多次查痰。菌阳患者1 个痰标本涂片检查约80% 阳性，2 个痰标本涂片检查约90%阳性，3 个痰标本涂片检查约95% 阳性。通常初诊患者要送三份痰标本，包括清晨痰、夜间痰和即时痰，如无夜间痰，宜在留清晨痰后2 ～ 3 小时再留一份痰标本。复诊患者每次送两份痰标本。无痰患者可采用痰诱导技术获取痰标本。

（2）痰涂片检查：简单、快速、易行和可靠的方法，但欠敏感。

每毫升痰中至少含5000 ～ 10000 个细菌时可呈阳性结果。常采用的是齐－尼氏染色法。痰涂片检查阳性只能说明痰中含有抗酸杆菌，不能区分是结核分枝杆菌还是非结核性分枝杆菌，由于非结核性分枝杆菌少，故痰中检出抗酸杆菌有极重要的意义。

（3）培养法：结核分枝杆菌培养为痰结核分枝杆菌检查提供准确可靠的结果，常作为结核病诊断的金标准。同时也为药物敏感性测定和菌种鉴定提供菌株。结核分枝杆菌培养费时较长，一般为2 ～ 6周，阳性结果随时报告，培养至8 周仍未生长者报告阴性。常用的培养方法为改良罗氏法和小川法。近期采用测定细菌代谢产物的BACTEC TB460 或BACTEC MGIT 960 法，约2 周左右可获得结果。

（4）药物敏感性测定：主要为临床耐药病例的诊断、制定合理的化疗方案以及流行病学监测提供依据。

（5）其他检测技术：如聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针检测特异性DNA 片段、色谱技术检测结核硬脂酸和分枝菌酸等菌体特异成分以及采用免疫学方法检测特异性抗原和抗体等，使结核病快速诊断取得一些进展，但这些方法仍在研究阶段，尚需改进和完善。

4．纤维支气管镜检查

纤维支气管镜检查常应用于支气管结核和淋巴结支气管炎的诊断，支气管结核表现为黏膜充血、溃疡、糜烂、组织增生、形成瘢痕和支气管狭窄，可以在病灶部位钳取活体组织进行病理学检查、结核分枝杆菌培养。对于肺内结核病灶，可以采集分泌物或冲洗液标本做病原体检查，也可以经支气管肺活检获取标本检查。

5．结核菌素试验

广泛应用于检出结核分枝杆菌的感染，而非检出结核病。结核菌素试验对儿童、少年和青年的结核病诊断有参考意义。由于许多国家和地区广泛推行卡介苗接种，结核菌素试验阳性不能区分是结核分枝杆菌的自然感染还是卡介苗接种的免疫反应。因此，在卡介苗普遍接种的地区，结核菌素试验对检出结核分枝杆菌感染受到很大限制。目前世界卫生组织和国际防痨和肺病联合会推荐使用的结核菌素为纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）PPDRT23，以便于国际结核感染率的比较。

结核菌素试验选择左侧前臂曲侧中上部l/3 处，0.lml（5IU）皮内注射，试验后48 ～ 72 小时观察和记录结果，手指轻摸硬结边缘，测量硬结的横径和纵径，得出平均直径=（横径＋纵径）/2，而不是测量红晕直径，硬结为特异性变态反应，而红晕为非特异性反应。

硬结直径≤ 4mm 为阴性，5 ～ 9mm 为弱阳性，10 ～ 19mm 为阳性，≥ 20 或虽＜ 20mm 但局部出现水泡和淋巴管炎为强阳性反应。结核菌素试验反应愈强，对结核病的诊断，特别是对婴幼儿的结核病诊断愈重要。凡是阴性反应结果的儿童，一般来说，表明没有受过结核分枝杆菌的感染，可以排除结核病。但在某些情况下，也不能完全排除结核病，因为结核菌素试验可受许多因素影响，结核分枝杆菌感染后需4 ～ 8 周才建立充分变态反应，在此之前，结核菌素试验可呈阴性；营养不良、HIV 感染、麻疹、水痘、癌症、严重的细菌感染包括重症结核病如粟粒性结核病和结核性脑膜炎等，结核菌素试验结果则多为阴性和弱阳性。

‘贰’ 耐药结核病的临床表现

以下为耐药结核病高发人群：
1、复治失败患者或慢性患者；
2、耐药结核病患者接触者；
3、初治失败；
4、短程化疗2或3个月末痰菌仍阳性患者；
5、复发或返回患者；
6、暴露于耐药结核病爆发或流行机构者；
7、耐药结核病高流行地区；
8、服用质量差或质量不明抗结核药物史者；
对以上患者均应行痰的结核菌培养及药物敏感试验明确是否为耐药患者。 1、在耐药结核病的化学治疗中，WHO根据药物的疗效、使用经验和药物分类将抗结核药物分为5组。
第1组即一线口服抗结核药物：异烟肼(H)、利福平(R)、乙胺丁醇(E)、吡嗪酰胺(Z)、利福布汀(Rfb)；
第2组即注射用抗结核药物：卡那霉素（Km）、丁胺卡钠霉素（Am）、卷曲霉素（Cm）、链霉素(Sm)；
第3组即氟喹诺酮类药物：氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)；第4组即口服抑菌二线抗结核药物：乙硫异烟胺(Eto)、丙硫异烟胺(Pto)、环
丝氨酸(Cs)、特立齐酮(Trd)、对氨基水杨酸(PAS)；
第5组即疗效尚不确切的抗结核药物：氯法齐明(Cfz)、利奈唑胺(Lzd)、阿
莫西林/克拉维酸(Amx/Clv)、氨硫脲(Thz)、亚胺培南/西司他汀(Ipm/Cln)、大剂量异烟肼（H）、克拉霉素(Clr)。
最新的研究结果显示，利奈唑胺对结核分枝杆菌具有强大的杀菌作用，临床用于治疗MDR-TB也取得了一定疗效。二芳基喹啉类药物、硝基咪唑吡喃类药物、二胺类药物、吡咯类化合物以及甲硫达嗪等对MTB均显示了良好的杀菌活性，部分药物正在进行临床试验中。
2. 耐药结核病化疗的基本原则：
(1)对耐药结核病患者应进行早期诊断和及时治疗。
(2)根据患者的用药史、耐药MTB菌株的流行情况以及可供选用的药物设计化疗方案。
(3)化疗方案中至少应含有4种确定有效或几乎确定有效的核心药物(1～4组中的敏感药物或从未使用过的药物)。
(4)药敏试验结果出来前应根据国家有关规范，按照患者的结核病类型(Ⅰ～Ⅳ)给予相应的经验性治疗，待药敏试验结果出来后再根据病情调整用药。需要指出的是，药敏试验必须是实验室质量可以得到保证，且应具有良好的可重复性和较高的可信度。异烟肼和利福平的准确度最高；而E、Z、和S等准确度较低，第4、5组药物可靠性也未完全肯定，因此，这些药物的药敏试验结果不能完全预测该药临床治疗是否有效或无效，在实际选药时可不完全依赖其实验室结果。
(5)按照5组抗结核药物顺序选药，在1～4组抗结核药物不足以组成有效的耐药结核病化疗方案时才考虑从第5组药物中选择用药。
(6) 选用第4组药物时应首选Eto/Pto，因其成本较低且疗效确切。如果不考虑成本，应首先选用PAS，其肠衣制剂耐受性较好。如果需要从第4组药物选用2种药物，通常使用Cs加用Pto/Eto或PAS。Pto/Eto和PAS合用具有很高的胃肠道不良反应发生率，因此只有当第4组内的药物全部需要选用时，才考虑将这两种药物联合使用。
(7) 同一类药物不能联合使用，例如注射用抗结核药物、氟喹诺酮类药物等。
(8) 单向耐药时务必遵循阶梯用药原则，逐级使用。
(9) 具非完全性双向交叉耐药的抗结核药物例如利福类中的利福平、利福喷汀和利福布丁以及氟喹诺酮类中Ofx、Lfx和Mfx等，当耐R或Ofx时可以从利福喷汀和Rfb或Lfx和Mfx中选用，但对后者耐药时则不能再使用前者。
(10) 具完全性双向交叉耐药的抗结核药物类如氨基糖苷类中的Km和Amk、硫胺类中的Eto和Pto以及Cs和Trd，当其中任一药物耐药时，不能再选用同组中的另一药物。
(11)采用全程每日用药法。
(12)实施全程督导下化学治疗管理(DOTS)。
(13)及时发现和处理抗结核药物的不良反应。
3. 耐药结核病化疗方案的制订：
化疗仍然是耐药结核病的主要治疗手段，其化疗方案应根据患者用药史、耐药情况以及本地区耐药结核分枝杆菌菌株的流行情况等进行综合制定。
单耐药结核病往往为初始耐药或原发性耐药结核病，使用初治结核病标准化疗方案将仍然有效。但由于此时的初治结核病标准化疗方案存在着治愈率下降或增加复发的可能性，因此，对于单耐药结核病尤其是单耐R，其化疗方案应进行适当调整，以尽量避免可能存在的治疗失败和产生获得性耐药的风险。
多耐药结核病的耐药情况比单耐药结核病要复杂许多，耐药组合形式多样，可分为2种药耐药、3种药耐药和4种药耐药3种基本类型，对于这些患者再采用标准化疗方案治疗会产生更大的风险，应针对各种耐药组合的形式进行相应的药物调整，以确保方案中有4种有效或几乎有效的核心药物。
MDR-TB化学治疗的基本策略：
(1)标准化治疗方案：该方案是指根据某国家或某地区有代表性的耐药监测资料和不同类别患者而设计的一组治疗方案，同一国家(地区)或同一类别的所有患者使用同一种治疗方案。
(2)个体化治疗方案：该方案则是根据每个患者抗结核治疗史和药敏试验结果来确定的，不同患者的方案不同。
(3)经验性治疗方案：该治疗方案是根据每个患者既往用药史和某国家(地区)既往有代表性的耐药监测资料进行确定，并可根据药敏试验结果进行调整，这类治疗方案主要适合于不能进行药敏试验的地区。该基本策略也适用于其他类型耐药结核病。
目前尚缺乏治疗XDR-TB的有效化疗方案，往往以营养支持、缓解症状、改善呼吸功能、控制其他病原体感染等措施为主。对于低代氟喹诺酮类药物耐药而高代敏感以及注射用抗结核药物中的Amk或Cm仍然敏感或可能敏感的话，可以再尝试从第5组疗效不确切药物中选用2种以上药物组成化疗方案。 1、免疫治疗
耐药肺结核患者常常免疫功能低下，尤其是重症患者提高细胞免疫功能，提高吞噬细胞的吞噬能力，对消灭结核分枝杆菌有积极意义。目前研究最为活跃且比较成熟的两类免疫制剂有细胞因子制剂如干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2（IL-2）和母牛分枝杆菌菌苗等。
2、中医药治疗
中医药通过辨证论治，对每个结核病患者进行机体调节来提高其免疫功能，改善患者的全身状况及临床症状，如咯血、咳嗽、饮食、低热、盗汗等，从而达到辅助治疗耐药结核病的作用。
3、营养支持治疗
耐药结核病可导致营养不良，而耐药结核病患者也可因营养不良而使病情进一步恶化。因此，对耐药结核病患者给予营养支持治疗很有必要。如可添加维生素和矿物质成分，对全身情况极差、重度营养不良者可予补充脂肪乳剂、白蛋白等。
总之，耐药结核病的治疗应采取以化学治疗为主的综合性治疗措施，才能取得最佳的疗效。

‘叁’ 怎么面对结核菌的耐药性

结核菌的耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发性耐药）。但多耐的产生主要可能由于后者。耐药基因在染色体上，对不同药物的耐药基因不相连接，所以联合用药治疗有效。对异烟肼耐药与katG基因丢失有关。易感株有该基因，耐药株无。利福平主要作用于RNA多聚酶。编码该酶的基因(rpoB)突变则引起对利福平耐药。1999年国内报道7株耐利福平株全部rpoB基因发生突变。敏感株则否。科学家还发现这种细菌的遗传选择率低。它们通过一种称为遗传漂变（genetic drift）的过程积累它们的DNA的突变，而且几乎没有抑制这些突变的选择压力。由于这个原因，带来耐药性的突变不会从基因库中消失，而会持续存在于种群中。

通常，带来耐药性的遗传突变会对细菌造成损害，因为它们的获得是以细菌的其他机制被削弱为代价的。细菌的这种另外的机制抑制着它们的耐药性。但是这对于结核病并非如此。

‘肆’ 叙述结核杆菌的检验程序

结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。
结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。

一、结核杆菌检验程序
结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。

二、结核杆菌培养特性
1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。
2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。
3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。

三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。
【材料】
1. 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。
2. 抗酸染色液
3. 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。
【方法】
1. 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。
2. 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。
3. 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。
4. 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。
【结果】
1. 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。
2. 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。
3. 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。
4. 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。

四、荧光染色法
此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。

五、结核杆菌毒力试验——动物试验法

【材料】
1. 动物：体重200~250克豚鼠2只
2. 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。
2. 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下0.1ml
3. 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。
4. 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。
5. 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。

六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）
【材料】
结核病人24小时痰液，细口瓶，0.02%酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量0.5%NaOH摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。
2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。
3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。

(二)沉淀法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入0.02%酚红指示剂0.1毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。
2. 矫正PH为7.0，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。
3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。

附录：抗酸染液的配制
1. 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。
2. 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液0.1毫升即成。

‘伍’ 结核杆菌用什么方法检测

结核杆菌培养特性 1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。 详细的检测方法生物帮上面有的，蛋白质互作 http://www.bio1000.com/zt/protein/232119.html

‘陆’ 什么样叫耐药性结核有什么症状

结核病是一种经呼吸道传播的慢性传染病，在全球广泛流行。如果病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。WHO 2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0%，耐多药率为5.3%，估计全球耐多药结核病为50万例，其中，被WHO认定的27个耐药高负担国家占了病例总数的85%。特别是随着人口的增长、世界范围内的旅行和人口流动的增加，耐药性肺结核病例更趋上升态势，每年约增加30万新病例。耐药结核病的流行持续威胁着结核病控制工作已取得的进展，广泛耐药结核病的出现更加剧了这一威胁。
根据耐药种类分为以下四种：
1、单耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对一种一线药物抗结核药物耐药。
2、多耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对不同时包括异烟肼、利福平在内的一种以上的一线抗结核药物耐药。
3、耐多药（MDR－TB）：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实至少对异烟肼、利福平耐药。
4、广泛耐多药（XDR－TB）：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实除了至少对两种主要一线抗结核药物异烟肼、利福平耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗生素（如：氧氟沙星）产生耐药，以及三种二线抗结核注射药物（如：卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等）中的至少一种耐药。
根据病人是否接受过抗结核药物治疗以及耐抗结核药物的种数耐药结核病可分为：原发性耐药、初始耐药、获得性耐药、耐多药结核。
1、原发性耐药结核：指没有接受过抗结核药物治疗而发生结核杆菌耐药。
2、初始耐药结核：指经临床评估后，不能充分肯定以往没有接受过抗结核药物治疗)或治疗小于1个月而发生的结核杆菌耐药。包括原发性耐药和末发现的获得性耐药。
3、获得性耐药结核：指接受过抗结核药物治疗时间大于1个月而发生的结核杆菌耐药。
4、耐多药结核(MDR-TB)：指至少同时耐利福平和异烟肼的结核病人。
耐药结核病临床表现与普通结核病无明显差别，临床症状多种多样，轻重不等，与患者的年龄、机体的免疫状态、营养状态、并存疾病、入侵的结核分枝杆菌的毒力、菌量及病变部位及严重程度等均有关系。临床可表现发热、不同程度咳嗽、咳痰，部分患者可有咯血，病变广泛时可有呼吸困难等。肺外耐药结核病的临床表现据不同发病部位而不同。

‘柒’ 如何用PCR技术检测结核杆菌

结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.

一、结核杆菌DNA的提取

在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应<约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.

二、引物的设计

根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.

(一)编码结核杆菌抗原的基因序列

1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.

2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.

3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化DNA.

4.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.

5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.

(二)结核杆菌基因组重复序列

1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.

2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.

(三)人型结核杆菌特异序列

mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.

(四)分枝杆菌dnaJ基因

该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.

(五)rRNA序列

用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达0.1fg化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.

三、PCR产物的检测方法

通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.

四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性

(一)PCR的特异性

PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.

PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.

另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.

(二)PCR的敏感性

PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.

五.PCR在结核病临床诊断中的应用

PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:

1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.

2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.

3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.

4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.

5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.

六、PCR在检测TB中的注意事项

PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.

发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.

‘捌’ 关于多重耐药菌监测，包括哪些内容

具体如下：

加强对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的细菌和多重耐药的鲍曼不动杆菌等实施目标性监测。

及时发现、早期诊断多重耐药菌感染患者和定植患者，加强微生物实验室对多重耐药菌的检测及其对抗菌药物敏感性、耐药模式的监测，根据监测结果指导临床对多重耐药菌医院感染的控制工作。

多重耐药菌（MDRO）主要时指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌，常见的有耐甲氧金黄葡萄球菌（MRSA），耐万古霉素肠球菌（VRE），产超光谱β-内酰胺酶（ESBLS）细菌，耐碳青霉稀类抗菌药物肠杆菌（CRE），耐碳青霉稀类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CR-AS），多重耐药/泛耐药性铜绿假单胞菌（MDR/PDR-PA）和多重耐药结核分枝杆菌等。

抗菌药物在人类战胜各种感染性疾病的过程中发挥了关键作用，但由于抗菌药物不合理使用﹑免疫抑制剂应用以及侵入性操作的开展，导致多重耐药菌（MORO）的感染形势日益严峻，由于多重耐药菌存在对多种抗菌药物无效的特征，且常定植于患者体内形成潜在感染源，故一旦在医院内出现感染或传播，将十分难以控制，给治疗和防控带来很大压力。

(8)临床检测结核杆菌的耐药谱的方法扩展阅读：

医疗机构应当采取措施，有效预防和控制多重耐药菌的传播。主要包括：

（一）加强医务人员的手卫生。

医务人员对患者实施诊疗护理活动过程中，应当严格遵循手卫生规范。医务人员在直接接触患者前后、对患者实施诊疗护理操作前后、接触患者体液或者分泌物后、摘掉手套后、接触患者使用过的物品后以及从患者的污染部位转到清洁部位实施操作时，都应当实施手卫生。手上有明显污染时，应当洗手；无明显污染时，可以使用速干手消毒剂进行手部消毒。

（二）严格实施隔离措施。

医疗机构应当对多重耐药菌感染患者和定植患者实施隔离措施，首选单间隔离，也可以将同类多重耐药菌感染患者或者定植患者安置在同一房间。不能将多重耐药菌感染患者或者定植患者与气管插管、深静脉留置导管、有开放伤口或者免疫功能抑制患者安置在同一房间。

医务人员实施诊疗护理操作中，有可能接触多重耐药菌感染患者或者定植患者的伤口、溃烂面、粘膜、血液和体液、引流液、分泌物、痰液、粪便时，应当使用手套，必要时使用隔离衣。完成对多重耐药菌感染患者或者定植患者的诊疗护理操作后，必须及时脱去手套和隔离衣。

（三）切实遵守无菌技术操作规程。

医务人员应当严格遵守无菌技术操作规程，特别是实施中心静脉置管、气管切开、气管插管、留置尿管、放置引流管等操作时，应当避免污染，减少感染的危险因素。

（四）加强医院环境卫生管理。

医疗机构应当加强诊疗环境的卫生管理，对收治多重耐药菌感染患者和定植患者的病房，应当使用专用的物品进行清洁和消毒，对患者经常接触的物体表面、设备设施表面，应当每天进行清洁和擦拭消毒。出现或者疑似有多重耐药菌感染暴发时，应当增加清洁和消毒频次。

四、加强抗菌药物的合理应用

医疗机构应当认真落实《抗菌药物临床应用指导原则》和《卫生部办公厅关于进一步加强抗菌药物临床应用管理的通知》（卫办医发〔2008〕48号）要求，严格执行抗菌药物临床应用的基本原则，正确、合理地实施抗菌药物给药方案，加强抗菌药物临床合理应用的管理，减少或者延缓多重耐药菌的产生。

五、加强对医务人员的教育和培训

医疗机构应当对全体医务人员开展有关多重耐药菌感染及预防、控制措施等方面知识的培训，强化医务人员对多重耐药菌医院感染控制工作的重视，掌握并实施预防和控制多重耐药菌传播的策略和措施，保障患者的医疗安全。

六、加强对医疗机构的监管

地方各级卫生行政部门应当高度重视多重耐药菌的医院感染预防与控制工作，加强对医疗机构的监督、管理和指导，促进医疗机构切实实施预防、控制多重耐药菌感染的各项工作措施，保障医疗安全。

‘玖’ 结核病的实验室检查具体有什么呢

结核病的实验室检查有这些：

（1）结核菌细菌学检查痰涂片查抗酸杆菌是WHO推荐的肺 结核诊断方法，是全世界的结核病实验室都在使用的最基本的细菌学检 查方法。痰涂片检查不仅可以明确结核病传染源，而且十分经济，符合 我国国情。涂片的优点是简便、快速、价廉。涂片的缺点是阳性率低。 结核菌培养仍是目前诊断支气管结核病（MTB)的金标准，缺点是培养 时间长，特异性差。(2) 免疫学检测技术

① 皮肤变态反应：结核菌素或PPD实验，临床意义同前。

② 结核抗体测定：目前常用的检测方法主要有ELISA、免疫层析试 验、免疫印迹试验和蛋白芯片技术等检测血清抗体方法。

③ 结核抗原测定和循环免疫复合物（CIC)测定。

(3) 干扰素分析为体外测定结核菌抗原刺激诱发的T淋巴细胞分 泌y干扰素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物学方法检测核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR)可 检测样本中的结核杆菌核酸，并能鉴别耐药株。

(5) 血沉多增快，结合临床表现及X线检查可协助判断结核病的 活动性。