单抗阳性菌株检测方法

⑴ 单克隆抗体在临床上的应用

1．检验医学诊断试剂 作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于： ①病原微生物抗原、抗体的检测； ②肿瘤抗原的检测； ③免疫细胞及其亚群的的检测； ④激素测定； ⑤细胞因子的测定。 单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。 2．蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。 3． 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。目前单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。

⑵ 单克隆抗体的制备技术路线和关键点

动物的选择与免疫

1．动物的选择 纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫 1×107/0.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫 1×107/0.5ml ip

↓3周后

加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

↓

取脾融合

细胞融合

1．细胞融合前准备

（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名 称
来 源
耐 受 药 物
Ig链

H L

P3/X63-Ag8(X63)
BALB/C骨髓瘤MOPC-21
8-氮鸟嘌呤
r1 K

P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)
P3/X63-Ag8
8-氮鸟嘌呤
－ －

P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
P3/X63-Ag8
8-氮鸟嘌呤
－ K（不分泌型）

P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)
（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤
8-氮鸟嘌呤
－ －

SP2/0-Ag14(SP2/0)
（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤
8-氮鸟嘌呤
－ －

F0
BALB/C骨髓瘤
8-氮鸟嘌呤
－ －

S194/5.XXO.BU.1
P3/X63-Ag8
5-溴脱氧尿嘧啶核苷
－ －

MPC11-45.6TG1.7
BALB/C骨髓瘤MPC-11
6-巯鸟嘌呤
r2b K

210.RCY3.Ag1.2.3
LOU大鼠骨髓瘤R210
8-氮鸟嘌呤
－ K

GM15006TG-A12
人骨髓瘤GM1500
6-巯鸟嘌呤
r1 K

U-266AR
人骨髓瘤U-266
8-氮鸟嘌呤
ε λ

骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节 需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2．细胞融合的步骤

（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min

↓

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml

↓

加入96孔板，100μl/孔

↓

放入37。c CO2孵箱培养

（2）制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

↓

无菌取脾脏，培养液洗 一次

↓

脾脏研碎，过不锈钢筛网

↓

离心，细胞用培养液洗2次

↓

计数

↓

取108脾淋巴细胞悬液备用

（3）制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

↓

用无血清培养液洗2次

↓

计数，取得×107细胞备用

（4）融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④离心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

选择杂交瘤细胞及抗体检测

1．HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

2．抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。

杂交瘤的克隆化

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

1．有限稀释法克隆

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。

（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。

2．软琼脂培养法克隆

（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。

①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（6）4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

杂交瘤细胞的冻存与复苏

1．杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。

细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2．细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。

单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：

1．抗体特异性的鉴定 除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2．McAb的Ig类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。

3．McAb中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4．McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

5．McAb亲合力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

参考：http://www.foodmate.net/topic/163/3/34067.html

⑶ 单克隆抗体的鉴定实验

1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。
ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型的试剂盒说明书 1、首先将试剂盒恢复室温（大约30分），然后用纯水把清洗液配成工作浓度（一份浓缩清洗液加19份纯水）。
2、取出酶标板。每个标本需要6孔，阳性对照6孔。多余的用自封袋保存，记得放入干燥剂。
3、将细胞培养上清（或特异亲和纯化的抗体）50μl加入酶标微孔板，每个标本加6孔，阳性对照也是加6孔每孔50μl。然后每孔再加入50μl标本稀释液。贴上封板膜37℃温育30分钟。
4、弃去板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μl，通用阳性对照的6孔也一样。在加样图上或酶标板上做好标记。贴上封板膜37℃温育30分钟。
5、吸弃板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。
6、本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果，看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。更可将反应终止液（每孔50μl）终止反应后用酶标仪450nm测定波长，630nm参考波长双波长测定结果，参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。阳性对照0D小于0.5实验无效，需要重做。 1、虽然本试剂盒过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用。
2、在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万，虽然可以分辨但并不建议您这样做。此类样品成分十分复杂，有干扰结果的可能。在此种情况下您可以选择本公司的C030215抗体鉴定试剂。它会给您带来满意的结果。
3、手洗板子时一定要把孔加满，停留10秒然后弃尽，最后要拍干净。特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出，要吸净。这个在手工洗板时对结果很重要。
4、一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好，随盒存放。
5、拿放板子时不要剧烈抖动，以免孔间交叉污染出现错误结果。
6、出现异常结果请随时咨询我们。
3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。
4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

⑷ 单克隆抗体的制备过程中，检验阳性是什么意思

单抗的制备中，经筛选后的杂交瘤细胞产生的抗体是不一样的，其中有些是我们所需要的单克隆抗体，所以要把筛选后的杂交瘤细胞在多孔板上培养，每个小孔中只有一个细胞，然后用抗原去试，呈阳性的就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

⑸ 幽门螺旋杆菌的检测方法是什么

目前检测幽门螺旋杆菌的方法有：一、呼气试验，即碳13或碳14呼气试验，需要早晨空腹去检查，先吞服一颗尿素酶胶囊，隔15分钟后再吹气检查，结果比较精确；二、胃镜下检查，通过胃镜下取黏膜组织行快速尿素酶试验；三、抽血检查，抽血检查幽门螺旋杆菌抗体，结果呈阳性提示近期或正在有感染；四、取大便化验幽门螺旋杆菌抗体，结果准确性相对差一点。

⑹ 如何针对一名细菌感染患者进行病原生物学的诊断

摘要：病原微生物种类繁多，变异迅速，快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进着。目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、多聚酶链反应等，该文对这些检测技术进展做一综述。 对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，往往造成世界性大流行，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法，自动化程度高，快速省时、无污染、结果精确，可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1．1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和设备，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1．2 分离培养与生化反应 分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间，检测周期较长，不能同时处理批量样本。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，传统鉴定方法也在逐步改进，大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪，可同时做细菌鉴定和药敏试验，检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高，常规培养阳性率低。雍刚 等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基，大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌，生长指数明显高于血平板。1．3 组织细胞培养 活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的，将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养，再将病原体接种于相应的组织细胞中后，病原体可在其中繁殖增长，引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内，引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性，不仅可检测样本中病原体抗原，也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50％ ～80％ ，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染，其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高，ELISA应用于乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物，在外部磁场磁力的作用下，将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠，如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用到各级科研和实验室 。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测，检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌，免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测，肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS．PCR检测，检测时间缩短到10 h，最低检测限可达10cfu·g～，有研究者利用IMBS结合实时荧光定量PCR(IMBS—RT—PCR)成功检测出了水中的轮状病毒和草莓的诺如病毒，检测时间大大缩短；Leon—Velarde等利用IMB8结合酶联检测，大大提高了沙门菌的检测效率。3 基因检测随着科技水平发展，分子生物学检测技术日新月异，对病原微生物的鉴定已不再局限于对普通外部形态结构和生理生化特性等的一般检验上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特异的，有别于其他种或属，检测其特有的基因片段序列可用来鉴别病原微生物。随着科技的发展，基因检测技术逐渐代替其它检测技术，成为临床检验科和基础实验室对病原体的主流检测技术。3．1 核酸杂交技术具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔成异质双链的过程叫核酸杂交，其杂交双方是所使用探针和要检测的核酸。在病原微生物检测中核酸分子杂交主要包括膜上印迹杂交和核酸原位杂交两种。膜上印迹杂交是指将核酸从微生物细胞中分离出来，纯化后在体外结合到一定的固相支持物上，与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交。核酸原位杂交是指标记的核酸探针直接与细胞或组织切片中的核酸进行杂交。探针还可以用荧光标记，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下即可鉴别病原体还可显示在三维空间中的位置。核酸分子杂交检测技术与其它方法相比显着地优点是简便、敏感、快速、特异。Wong 等用荧光标记2个不同的寡核苷酸探针从血液标本中检测出假单胞菌属和不动杆菌属的细菌，最低检测限为10 cfu·mL～，特异度为100％ ，检测时间不到2 h。寡核苷酸探针是针对病原体特异基因序列设计的，可以将待检测的病原体定位在不同的分类等级，如科、属、种、亚种“ 。（病原微生物检测技术进展）3．2 基因芯片技术基因芯片(DNA chip)又称为DNA微阵列(DNA microarray)或DNA芯片，是生物芯片的一种 j，是核酸分子杂交技术发展延伸而来的。通过微加工技术，将数以万计甚至百万计的基因探针即DNA片段有规律地排列成二维DNA探针阵列，固定到硅片、玻片等固态支持物上，与标记的样品分子进行核酸杂交，用于基因检测工作。其测序原理与核酸杂交一样，但解决了传统核酸杂交技术操作繁杂、检测效率低、自动化程度不高的缺点。基因芯片在病原微生物感染诊断上的应用，大大缩短了确诊所需要的时间，而且能检测出病原体是否耐药、对那些抗生素耐药、对那些抗生素敏感。Naas 等设计的基因芯片可以检测出铜绿假单胞菌、肠杆菌属、鲍氏菌属中各型B一内酰胺酶类耐药基因。蔡挺等设计的基因芯片检测出大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌对l7种抗菌药物的耐药率。Batchelor 等开发的基因芯片可以检测出编码耐超广谱8．内酰胺酶、磺胺类、四环素类、氨基糖甙类等47个耐药基因的大肠埃希菌和沙门氏菌。基因芯片技术同样还有些问题有待解决，如提高芯片的特异性和检测信号的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多数芯片都需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。（病原微生物检测技术进展）3．3 PCR技术聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外是用已知寡核苷酸引物引导未知片段中微量待测基因片段并进行扩增的技术。由于PCR可以对待测基因进行扩增，特别适用于病原体感染早期的诊断，但是如果引物特异性不强，可能会造成假阳性的出现。PCR技术在近20年里发展迅速，从基因扩增到基因的克隆和改造以及遗传分析，可靠性逐步提高。Jbara 用PCR和传统法直接检测75例样本中的流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌，与传统方法相比，PCR检测的特异度和灵敏度分别为87．3％ 和100％ 。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反应体系里加上二对以上引物，可同时扩增出多个核酸片段，适合大量样本的分析与鉴定。多重PCR具有：(1)高效性，在同一反应体系内可同时检出多种病原微生物，或对同一病原微生物的不同型别进行分型；(2)系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如几种肝炎病毒同时感染；淋球菌、梅毒螺旋体、艾滋病病毒等多重性病病原体的感染；需特殊培养的无芽胞厌氧菌感染；破伤风杆菌，炭疽杆菌，产气荚膜杆菌，鼠疫耶尔森菌等战伤感染细菌感染；(3)经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时被检出，节省试剂、节约费用、节省时间，为临床提供更快更多更准确的诊断信息。Reyes等 用多重PCR从90例发热但培养阴性的儿童细菌性脑膜炎脑脊液样本中检测出了脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，特异度100％ ，敏感度89％。实时荧光定量PCR，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高度特异、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时荧光定量PCR对性病病原体早期确诊、窗口期筛查、疗效检测、基因变异分析和预后评估等具有重要价值，为流行病学调查提供帮助 J。王娉等 建立了多重实时荧光定量PCR反应体系，同一体系能同时快速检测出耐甲氧西林和产肠毒素A的金黄色葡萄球菌。荧光基团标记的特异性引物可准确反映病原体感染和药物疗效，特别适用于不可人工培养和难以培养的病原体如病毒、衣原体等感染的诊断。基因芯片技术与多重PCR结合可以通过PCR对目的基因进行放大，通过基因芯片的荧光探针增加检测的灵敏性和特异性，使得两种检测技术的优势互补，已广泛应用于病原微生物的检测。将病原体特异性基因作为靶基因设计出引物与探针，进行多重PCR扩增，制备出寡核苷酸芯片，再对待测样本靶基因进行多重PCR扩增，将扩增产物与病原菌多重PCR基因芯片检测体系杂交，可根据杂交信号直观地判读样品中所含病原体的种类、型别、毒力、侵袭力，从而对病原体进行检测和鉴定。（病原微生物检测技术进展）3．4 其它基因检测技术分子生物学技术飞速发展，各种新的基因检测手段不断出现。Notomi等于2000年开发出一种新的环介导恒温核酸扩增法(1oop—mediated isothermal amplifi—cation of DNA，简称LAMP)，针对靶基因序列上6或8个特异区域设计出4或6条引物，在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下形成环状结构和链置换对目标DNA大量扩增。短短几年LAMP已被广泛应用于疾病诊断、食品检验、环境监测、生物安全等各方面心 ]。李蒙等 运用LAMP法60 min检测了16例开放性伤口深部伤口感染分泌物中的破伤风芽孢梭菌，其中阳性为4例，最低检测限为4 x 10 。有研究报道l2 用LAMP技术快速检测了200例肺结核患者的痰标本，结核分枝杆菌的阳性检出率远远高于培养法和染色法。多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple—locus Variable—nun—ber Tandem repeat Analysis，MLVA)是一种根据病原体基因组中可变数目串联重复序列的特征来对病原体基因分型的一种技术，广泛应用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌等的基因分型与鉴定 ⋯。4 小结与展望对病原体进行快速准确的检测和鉴定是传染病防治工作的首要问题。随着生物学研究由宏观领域向微观领域的发展，病原体检测方法也从组织形态学水平深入到分子水平、基因水平。近年来发展起来的病原微生物高通量检测技术样本需要量少、快速省时、无污染、诊断结果精确、自动化程度高，相信随着研究的不断进展和深入，这些高通量诊断技术和方法必将在病原微生物的诊断分析方面起到越来越重要的作用，而多种检测技术的联合和综合更是有着广阔的应用前景。

⑺ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

⑻ 本人想做一种鉴定细菌的单克隆抗体，求助

1、免疫：
将培养好的细菌用PBS或生理盐水充分洗涤几次后，用麦氏比浊管进行比浊计数，计数后就可以进行免疫了。
2、检测：
用你做的细菌的特异性抗原决定簇所在的抗原（膜抗原、鞭毛抗原等）进行包被酶标板。
3、特异性鉴定：
用与你做的细菌具有相似结够的细菌做交叉反应。
其他的步骤跟常规做单抗的步骤一致。

⑼ 如何实现快速检测及有效控制沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠杆菌, 也是肠杆菌科中最主要的食源性致病菌。据有关资料统计由沙门氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所占比例已超过三分之二，2007年发生的“ 花生酱事件”以及 2008 年发生的“ 西红柿 事件”等[1]沙门氏菌中毒事件的发生也使得食品中沙门氏菌的检测受到人们的普遍关注。本文主要是对食品中沙门氏菌的传统检测方法以及后续建立的以分子生物学、免疫学、生物传感器和电化学为基础的快速检测方法进行了系统的综述，旨在为该致病菌的检测方法的研究应用提供一定的参考。
1、 传统的检测方法（国标法）
目前, 我国对食品中沙门氏菌的检测大多采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品样品进行检测，这种传统的培养方法可分为前增菌、增菌、分离培养、生化试验和血清学鉴定等步骤进行。虽然传统培养法可靠性高，但是其操作繁琐且耗时费力，并不能满足食品快速检测的要求。
2、分子生物学检测方法
2.1聚合酶链反应技术
PCR技术是一项敏感性高、特异性强且快速准确的微生物检测技术，也被许多学者用于对食品中沙门氏菌进行检测和研究。汪琦等[2]就采用传统培养方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 种方法对沙门氏菌进行检测。在常规PCR的基础上宋东晓[3]建立了检测食品中沙门氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技术也运用于食品中沙门氏菌的检测，钟伟军[4]通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法，此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
2.2核酸探针技术
核酸探针技术是根据核苷酸碱基互补的原理,在已变异的DNA样品中加入用同位素等标记的DNA特异片段，在一定条件下两片段进行杂交从而达到检测DNA的目的。此技术不仅简便、快速而且敏感性高、特异性强，已用于食品中沙门氏菌的检测。Almeida等[5]通过建立一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中沙门氏菌进行了检测，准确度高达 100%。
2.3基因芯片技术
基因芯片技术是利用已知核酸序列的探针与靶核苷酸序列杂交，然后通过信号检测对其进行定性与定量分析，在沙门氏菌等各种致病菌的分析检测中有很好的应用前景。饶宝等[6]通过建立检测致病菌的基因芯片检测方法，设计了通用引物和特异性探针: 沙门氏菌探针、大肠杆菌探针和金黄色葡萄球菌探针,实现了同时检测并区分沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的目的。祝儒刚等[7]运用多重 PCR 结合基因芯片技术建立了检测肉及肉制品中的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌等5种食源性致病菌的快速检验方法。
2.4噬菌体裂解技术
噬菌体有特异性裂解细菌的作用。张碧波等学者利用此技术进行沙门氏菌
快速检测，结果和其他学者相同，据此得出特异性噬菌体可以检测出沙门氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌体裂解对150份食品样品进行快速检测，结果说明肠杆菌科噬菌体组合对培养10h的沙门氏菌敏感性和特异性较高，这对实现沙门氏菌实时、快速而准确的检测有重要意义。
2.5环介导等温扩增技术（LAMP）
环介导等温扩增技术是2000年Notomi等开发的一种新的恒温核酸扩增方法,此方法的特点是特异性强、灵敏度高且简单、快速,适合对大规模样品的快速检测[9]。李佳桐[10]通过实验建立了沙门氏菌的LAMP检测方法,并将此方法与常规PCR进行比较,结果显示：LAMP方法对沙门氏菌的检测恒温65℃下只需要40min,只扩增沙门氏菌,不会扩增其他革兰氏阴性菌,最低可检出浓度10cfu/mL,比常规PCR的最低检出浓度高1个数量级,通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,能够快速简便的观察检测出绿色的阳性结果十分明显的区别于橙色的阴性结果。
3、免疫学方法
3.1酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附法简称 ELISA， ,此技术敏感性高 ,不需特殊设备 ,结果观察简便，早在1977年就有报道将酶联免疫吸附法用于食品中沙门氏菌的检测。伍燕华等[11]设计捕获抗体和检测抗体，建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法对食品中的沙门氏菌进行检测。张帅等[12]建立双抗夹心ELISA体系，检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800CFU/g，等均并与其他血清型沙门氏菌、单增李斯特菌等菌均无交叉反应,特异性良好。
3.2免疫荧光标记技术
免疫荧光标记技术是根据抗原抗体的特异性反应，将荧光素标记在已知抗原(或抗体)上,与特异抗体(或抗原)结合后产生荧光，可用来定位抗原或抗体、并通过定量分析，确定测定含量。叶明强[13]基于纳米免疫磁珠富集,免疫量子点标记,建立了一种食品中沙门氏菌的含量进行快速检测的方法，研究出了一种新型的免疫荧光食源性致病菌检测技术。
3.3斑点免疫金渗滤法
免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物结合免疫原理的一种应用于抗原抗体的新型技术，该技术运用最广泛的就是斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技术对沙门氏菌的快速检测进行了研究，曹春梅等[14]是利用斑点免疫金渗滤法对沙门氏菌O9抗原进行了研究，结果表明此法简单、快速，适合推广运用；孔繁德等[15]是通过建立直接检测沙门氏菌的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒对该菌进行了研究。
3.4免疫磁性分离技术
免疫磁珠分离技术是将特定病原体的单抗或多抗与磁珠微球偶联，并通过抗原抗体反应形成磁珠，在外加磁场作用下磁珠会发生定向移动，从而达到分离目标病原体的作用。食品样品中致病菌含量很少，常规的方法是很难从中分离出来的，借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。王海明等[16]应用磁免疫技术建立快速检测食源性沙门氏菌的方法，结果表明此方法能对食品基质中的目标菌进行快速有效的富集,其检测限<10cfu/25g,检测周期约为40小时。胡霏[17]也通过实验针对鼠伤寒沙门氏菌建立免疫磁分离技术结合荧光层析技术的快速检测方法。
4、生物传感器技术
生物传感器是利用一些生物活性物质如酶 、多酶体系 、抗体等做为敏感器件，然后配以适当的信号传导器所构成的分析检测的工具。我国学者已采用此法对沙门氏菌的抗原、抗体的免疫吸附进行检测，并已用于快速检测食品中致病的沙门氏菌，而仅需 1h 完成，达到了快速的检测目的。宁毅[18]在对碳纳米管性质研究的基础上,结合分子探针构建了碳纳米管生物传感器，并将其用于沙门氏菌的检测，结果显示所构建的传感器灵敏度高、特异性强、稳定性好。
5、电阻抗技术
电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，因为具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点，目前此法已用于食品中沙门氏菌检测检验并已通过美国公职分析化学协会(AOAC)认可。陈广全等[19]建立了电阻抗法快速检测食品中沙门氏菌的方法，并将其与常规培养法进行比较，对食品中的沙门氏菌属进行检测,结果表明电阻抗法比传统培养法更加快速、可靠。
6、总结
综上所述，沙门氏菌检验技术正从传统的培养方法向分子检测方法改进，并向仪器化、标准化、自动化方向发展，并且食品安全、致病菌等问题对人类健康以及生活环境都造成了严重威胁，加强沙门氏菌检测势在必行。目前沙门氏菌快速检测技术大多具有检测迅速、灵敏度高、特异性强等特点，此外这些方法还具有各自的优点和局限性，在未来发展过程中需要我们不断改进和创新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙门氏菌快速检测技术。

⑽ 单克隆抗体制备中专一抗体检测阳性什么意思

检测阳性，就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。