传统培养检测方法

① 单细胞培养的方法有哪些各有什么特点

1.转瓶培养
这个比较老的工艺，在逐步淘汰，不过投资少，技术含量低，人员经少量培训就可以操作。
2.悬浮培养
非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。
利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～120 r/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。

② ccd在线检测与传统检测方法相比有哪些优点和缺点

传统检测：人工目测，依靠人工肉眼识别进行判断比较，最终判定产品的优劣，完成产品的质检审核环节。

CCD在线检测：以自动化机械代替人工，对产品进行系统的分析判断，剔除残次品，最终完成产品检测的质检环节。

CCD在线检测相较传统检测方法的优点：

1. 智能高效：自动化检测可进行快速识别检测，相较人工检测，速度会快得多，可有效提高检测效率，缩短产品出货周期，降低人工成本；

2. 标准统一：CCD检测是系统对被检物进行统一标准化的判断识别，一致度高，确保每个产品都是标准统一规范的判定模式，产品的标准输出可以得到有效保障；

3. 高速精准：智能检测可进行飞拍识别，并可对肉眼无法判断的微小精密物件进行识别检测，在提高效率的同时，更提高了检测的精密度；

4. 代替人工进行高危作业：在一些高危行业，例如高温，易爆，寒冷等恶劣的工作环境，用自动化机械检测，可有效代替人工作业，避免因突发情况对人体造成伤害；

5. 可保持长时间规范运作：相较人工，机器化的检测可保持长时间规范化产出，不会因为疲劳、瞌睡、注意力等人为因素导致误判、漏判的现象。

CCD在线检测相较传统检测方法的缺点：

1. 灵活度低：没有人工灵活，一些未出现过的缺陷不被系统识别，可能出现误判的情况；

2. 可识别的产品较为单一：CCD检测是根据算法进行产品识别的，当检测产品不统一，多样复杂且形状大小不一，或者更为复杂多变的情况下，难以像人工检测一样随机应变；

3. 识别局限性：类似编织面料的孔径大小检测，有伸缩弹力，产品的摆放状态难以实现标准化检测，人为更容易判断。

③ 致病菌感染的微生物学检查基本程序是怎么样的

病原微生物种类繁多，变异迅速，快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进着。目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、多聚酶链反应等，该文对这些检测技术进展做一综述。 对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，往往造成世界性大流行，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法，自动化程度高，快速省时、无污染、结果精确，可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1．1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和设备，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1．2 分离培养与生化反应 分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间，检测周期较长，不能同时处理批量样本。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，传统鉴定方法也在逐步改进，大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪，可同时做细菌鉴定和药敏试验，检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高，常规培养阳性率低。雍刚 等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基，大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌，生长指数明显高于血平板。1．3 组织细胞培养 活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的，将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养，再将病原体接种于相应的组织细胞中后，病原体可在其中繁殖增长，引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内，引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性，不仅可检测样本中病原体抗原，也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50％ ～80％ ，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染，其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高，ELISA应用于乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物，在外部磁场磁力的作用下，将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠，如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用到各级科研和实验室 。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测，检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌，免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测，肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS．PC

④ 肠炎沙门氏菌的检测方法

自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰病原的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。
1、传统的培养方法
用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌)，将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定)，但对培养基的选择仍存有争论。第二，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型：连四硫基盐肉汤(Tetrathionatebroth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果。
2、以抗体为基础的检测方法
利用抗原-抗体反应的显着特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体(ELISA)，荧光抗体染色(免疫荧光法)，同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，概括地说，是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。
黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelletest1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板，加入经增菌处理的样品，反应后再加入一定的指示剂，作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理，也可用此法进行沙门氏菌检测。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105～106个细胞/ml，因此，要得出可靠的结果，食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌，通常还要在含有D-甘露糖的肉汤(M肉汤)中进行后增菌，以促进鞭毛发育。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)样品制备过程分三步，共耗时24h：①选用营养肉汤进行预增菌(6h)，使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。②使用选择性培养基RV进行增菌(14h)，使沙门氏菌大量繁殖，同时抑制其它杂菌生长。③使用营养肉汤(蛋白胨水)进行后增菌(4h)，使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身，则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间，90min是孵育时间)。相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。最新式的沙门氏菌免疫学检测法，利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上，结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作，且由于无需要特殊设备，很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理，但它(卡片法)本身通常需时不超过10min，如果采用黎兆滚等人的样品制备法，则可使操作时间更为缩短。
3、以核酸为基础的方法
细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素、酶或发光的标识物。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DAN—RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h的增菌步骤后，检测极限可达108个细菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细菌细胞中存在5000～20000个复制体，而相比之下染色体DNA复制体仅2～10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。其另一优点是由于rRNA为单链(而DNA为双链)，杂交前无需经过变性步骤。要得到阳性结果，此法需要105个靶细胞/ml，因此对沙门氏菌检测来说，需要进行预增菌和选择性增菌，总共约50h。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。食品细菌检测法的最新进展是在化学扩增体系方面的发展，即聚合酶链反应(PCR)，用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。用于检测沙门氏菌和其它以食物为载体的病原的PCR方法业已建立，其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化，且必需经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点，但这种方法对那些含沙门氏菌较少或沙门氏菌“致伤”严重难以复苏而仍保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。

⑤ 进行菌种质量检测的常用方法有哪些

1、直接观察。对引进菌种观察包装是否合乎要求，棉塞有无松动，试管、玻璃瓶和塑料袋有无破损，棉塞和管、瓶或袋中有无病虫侵染，菌丝色泽是否正常，有无发生变化。然后在瓶塞边作深吸气，闻其是否具备特有的香味。原种和栽培种可取出小块菌丝体观察其颜色和均匀度，并用手指捏料块检验含水量是否符合标准。

2、显微镜检验。若菌丝透明，呈分枝状、有横隔、锁状联合明显，再加上具有不同品种固有的特征，则可认为是合格菌种。

3、观察菌丝长速。将供测的菌种接入新配制的试管斜面培养基上，置于最适宜的温、湿度条件下进行培养，如果菌丝生长迅速、整齐浓密、健壮有力，则表明是优良菌种，否则即是劣质菌种。

优质菌种的标准

食用菌的种类虽然繁多，但从总体上看，每一个优良菌种均有＂纯、正、壮、润、香＂的共性。其标准是：

1、菌种的纯度要高，不能有杂菌感染，也不能有其他类似的菌种。

2、菌丝色泽要纯正，多数种类的菌丝应纯白、有光泽，原种、栽培种菌丝应连结成块，无老化变色现象。

3、菌丝要粗壮，分枝多而密，接种到培养基吃料块，生长旺盛。

4、培养体要湿润，与试管（瓶）壁紧贴而不干缩，含水适宜。

5、具有每品种特有的清香味，不可有霉、腐气味。

⑥ 单细胞的培养方法有哪些

单细胞培养常见模型： ①在培养碟中原位单细胞微吸吮捕获、沉积分选培养模型传统的荧光活化细胞分选方法（FACS）采用流式细胞术用来分选细胞，是分子基础分选中普遍使用的方法。这种方法只能检测具有荧光活性的细胞，不但细胞存活率低、纯度低，而且极易破坏细胞组织。微吸吮单细胞分选培养模型是与倒置显微镜配合使用的，用于细胞筛选、提取、沉积的。 ◇ 可直接从培养皿中进行细胞分选 ◇ 分离粘结活细胞的细胞亚群，分离荧光或者冷光标记 ◇ 无标记的和荧光的细胞都可通过软件进行自动识别 ◇ 可确保细胞分离后活力，并且可培养 ◇ 分选荧光分子探针标记的特定细胞 ◇ 单细胞收集进行进一步培养、克隆，RNA 或者蛋白质制备 ◇ 免疫制备，进行目标细胞分类 ◇ 可对各种粘结细胞进行分类 ◇ 细胞筛选前的细胞培养 ◇ 一般的分选过程只需几分钟就可完成 ◇ 使用安装在显微镜上的荧光滤片可实现多通道监测 ◇ 分选速度为1Cell/秒每一个循环可筛选1~1000个细胞 ②单细胞培养分析跟踪板模型 ③使用把显微镜升级改造为纳米激光镊捕获操纵单细胞模型这种模型很简单，在已有显微镜上加上纳米激光器或芯片就可以了 ④使用活态单细胞激光拉曼光谱无损测定鉴别模型活态单细胞激光拉曼光谱无损测定鉴别模式可在无任何标记情况下对活细胞进行三维扫描测定其分子分布，更具优越性。活态单细胞激光拉曼光谱无损测定鉴别模式为医师，药师和生物学家提供了利用拉曼光谱的便利的方式，不仅可以识别各种基团，还可以对化合物进行高精确度分析，且对活细胞不需要使用生化标记物，荧光标记物或者抗体，对活细胞绝对安全。

⑦ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

⑧ 大肠杆菌的检测方法

多管发酵法。

多管发酵法是一种检测水体中大肠杆菌的传统方法，这种方法是在44.5℃的含有荧光底物的培养基上连续培养24h，而后能产生分解荧光底物——葡萄糖醛酸酶，从而释放出荧光产物，进而使培养基在紫外光照射下产生特征荧光。此方法可被用来对原样品中的菌落数作统计学估计。

在单料或双料乳糖胆盐发酵管内发酵，分离培养试验，利用伊红美蓝培养皿分离，接着是在乳糖发酵管中进行二次发酵，最后通过芽孢染色、革兰氏染色、显微镜观察等来完成。多管发酵法对试验条件要求不高，成本低，但是检测时间较长，容易受其他条件干扰，进而影响到测定结果的精确度。

(8)传统培养检测方法扩展阅读：

注意事项：

1、检样时注意无菌操作。

2、稀释时采用的稀释液可以用磷酸盐缓冲液或生理盐水，接种时可采用九管法，设置三个梯度，分别为0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一个稀释度的试管应充分混匀。

3、每次实验需要有阴性对照。

4、使用小倒管培养基配制时，为排净气泡，灭菌时不要把试管的盖子盖的太紧，灭菌后注意观察一下倒管中的气体是否排完全、

5、高压灭菌后等高压灭菌锅的压力表达到0，取出培养基放到冰箱冷却，效果会比较好。

⑨ 如何将分子生物学的原理应用于食品科学

基因芯片(gene chip) 技术是20 世纪90 年代兴起的前沿生物技术,它可以将生物学中许多不连续的分析过程,移植到固相的介质芯片上,并使其连续化和微型化。这对传统生物技术,如检测、DNA 杂交、分型和测序技术将是重大的创新和飞跃。由于它横跨生命信息、生物物理等众多的研究领域,涉及生命科学、化学、计算机学、生物信息学等诸多自然学科,故已成为当今多学科交叉、综
合的研究热点。基因芯片技术虽然仅有几年的发展历史,但在生物学的诸多领域已显示出巨大的潜力和诱人的前景。许多人认为基因芯片技术可以与单克隆抗体、PCR 技术、重组DNA 技术相媲美。针对DNA 分析的芯片又称DNA 芯片或基因
芯片, 根据核酸分析过程中的3 个主要步骤,DNA 芯片分为3 类:用于核酸样品制备的DNA芯片、用于核酸片段扩增反应的DNA 芯片和用于基因检测的DNA 芯片,后者又称微阵列,即DNA芯片。本文对基因芯片在食品致病菌检测中的应用作一介绍。
1 基因芯片技术检测食品致病菌的技术原理
基因芯片的基本原理是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA 经PCR 扩增后制备荧光标记探针,然后再与芯片上寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物 。
2 基因芯片技术在食品致病菌检测中的应用
2. 1 致病菌在食品中的危害
食品在生产、运输、销售过程中容易受致病性微生物污染,因此食品卫生检验中的一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的致病性微生物。这些致病性微生物的存在会给消费者的健康带来极大的危害。
2. 2 常规方法检测食品中致病菌的不足
目前,国内外对食品微生物中病菌的检测包括常见的致病菌,如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门氏菌等,常规检测方法主要有传统生化培养检测法、探针杂交、PCR 法。传统方法是采用细菌培养、生化鉴定与血清分型,由于操作简单、经济而被广泛采用,但检测时限长(一般要1～2 周) ,效率低、灵敏度不高。探针杂交和PCR技术准确、灵敏、快速( PCR 2～4 h ,探针杂交需要的时间稍长一些) ,弥补了传统方法的不足,国内外关于这2 种技术在医学微生物检测方面的研究报道很多。但PCR 法由于假阳性影响及检测成本昂贵而在应用中受到限制;探针杂交操作繁杂、检测时限长,因此这两种技术并没有真正在实际检测中得到大量应用。可见常规检测方法检测食品中的致病菌已经不能满足快速检测的要求,难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域,因此为了确保食品的安全性,开发快速检测致病菌的方法,准确地检测食品中的致病菌具有十分重要的意义。
2. 3 基因芯片技术检测食品中的常见致病菌
1996 年,世界上第一块商业化DNA 芯片的问世,标志着基因芯片技术进入广泛研究和应用的阶段[2 ] ,该技术具有传统的检测方法不可比拟的优越性3 ] : ①基因芯片可以对食品中的致病菌
实行高通量和并行检测,一次实验即可得出全部
检测结果; ②操作简便快速,整个检测在几小时内
即可得出检测结果; ③特异性强,敏感性高。随着
基因芯片检测食品中致病菌技术的不断发展和完
善,将广泛应用于出入境、食品安全指标、突发事
件等致病菌的检测,食品安全必将得到进一步保
障,并且将对整个食品领域产生深远的影响。
东北农业大学动物医学院的立广兴制备了地
高辛标记的空肠弯曲菌探针,北京医院临床检验
中心的杨华卫等研制了2 种以生物素标记对结
核分支杆菌特异性的DNA 探针[4 ] ; 李君文等[5 ]
应用基因芯片检测水中常见致病菌:可对水中致
病菌实行高通量、并行检测,一次实验即可得出全
部结果;靳连群等[6 ]利用基因芯片技术检测肠道
中的致病菌。结果显示制备的基因芯片能够检测
出沙门氏菌、志贺菌、葡萄球菌等。对于未知菌落
利用基因芯片能够在3 h 完成对未知菌属的鉴
定;南开大学王磊教授[7 ] 承担的“致病肠道细菌
—志贺氏菌检测基因芯片研制项目,近日取得重
大进展,该项目针对不同种志贺氏菌特异基因及
其探针已申请专利12 项。利用基因芯片检测食
品中志贺菌的时间已由传统检测方法的6 d 缩短
到了几小时。
Borucki 等[8 ]构建的混合基因组微阵列可准
确鉴别各种近缘单核增多李斯特菌分离物;
Volokhov 等[9 ]通过单管复合体扩增和基因芯片
技术检测和鉴别6 种李斯特菌;Call 等[10 ]通过分
析E. coli O157 : H7 的Shiga 样毒素Ⅰ,Shiga 样
毒素Ⅱ及溶血素A ,发现基因芯片可准确检测各
种E. coli O157 :H7 分离物。J ack[11 ]等通过设计
通用引物扩增细菌核糖体16S rRNA ,并将扩增
产物与含有探针的低密度芯片进行杂交,从而直
接检测鉴定微生物。Wilson 等[12 ]采用病原体诊
断区基因扩增和20 寡核苷酸藻红素标记探针,开
发出一套多病原体识别微阵列,可以准确识别18
种致病性病毒、原核生物和真核生物。
2. 4 基因芯片技术检测食品致病菌的程序
2. 4. 1 PCR 扩增引物及基因芯片探针设计 细
菌间16S rRNA 保守性强,在生物进化过程中比
其他基因演化得慢,被冠之以细菌分类的“化石”。
但细菌的16S rRNA 保守性又是相对的,在16S
rRNA 基因中既有序列一致的恒定区,也有序列
互不相同的可变区,恒定区和可变区交错排列。
因此可以在16S rRNA 恒定区设计PCR 引物,用
一对引物就可以将所有致病菌的相应基因片段全
部扩增出来,可在可变区设计检测探针并制作基
因芯片。
2. 4. 2 制备芯片 对芯片的介质表面进行氨基
化、硅烷化或二硫键修饰处理是基因芯片技术的
重要组成部分[13 ] 。利用基因芯片点样仪,将引物
及探针DNA 分子点涂在经过修饰的玻片等载体
上,即制成芯片。DNA 芯片的制作有几种不同的
方式: ①芯片外合成制备芯片,如化学喷射法和接
触式点涂法[14 ] ; ②原位合成制备芯片,如高压电
喷头合成法[15 ]和光引导原位合成法[16 ] 。所用寡
核苷酸均先已合成完毕,再固定于载体上。所用寡核苷酸均是在载体上被合成与固定,使成芯片。
芯片制备好后,便可用于检测食品中未知致病菌。
2. 4. 3 待测食品致病菌样品处理 待测致病菌
样品在培养后进行裂解, 提取致病菌的模板
DNA ,采用聚合酶链式反应(PCR) 扩增,对扩增出
来的产物进行荧光标记。再用2. 0 %琼脂糖凝胶
电泳检测,得到的荧光标记产物可用于杂交试验。
2. 4. 4 杂交 将扩增后并已标记的待测致病菌
DNA 标品滴加于基因芯片上,与芯片上的特异性
DNA 进行杂交。被检测的致病菌如果存在,其
DNA 便与芯片DNA 杂交成功,经洗涤晾干后,进
行结果分析。
2. 4. 5 结果检测与分析 采用芯片扫描仪,如荧
光扫描仪、共聚焦显微镜等进行检测,根据荧光的
有无及强弱来确定被测致病菌是否存在。
3 基因芯片技术存在的问题及展望
基因芯片技术作为一种新技术,具有快速、准
确、灵敏等优点,又能同时平行检测大量样本,但
是目前还存在一些关键的问题亟待解决: ①目前
的基因芯片一般都采用荧光标记技术,使得基因
芯片检测不仅需要昂贵的芯片制作系统,而且需
要昂贵的激光共聚焦扫描仪,高昂的价格严重限
制了这种芯片技术的普及应用; ②操作复杂、费
时,对操作人员的专业素质要求比较高,这也是限
制其普及应用的障碍之一; ③在样品目标物放大
反应的过程中,容易造成样品污染,也会影响到检
测信噪比,研究人员试图通过生物传感器吸附样
品加以避免,并结合半导体技术、纳米技术和生物
发光技术提高其灵敏度; ④生物芯片微细制备技
术以及如何提高生物芯片微阵列的密度也极大地
限制了该技术的市场需求,相信随着这些技术进
一步完善,基因芯片技术完全可能成为21 世纪最
具活力的技术之一。
基因芯片技术在食品致病菌检测中是一个全
新领域,国外已开始食品致病菌检测芯片的研究,
但仍处于早期研发阶段。而在国内,该领域仍处
于初步摸索阶段。基因芯片技术检测食品中致病
菌在不久的将来必将会标准化、商品化,人们可望
在一张芯片上检测到几乎所有致病菌,实现真正意义上致病菌检测的技术革命。

⑩ 如何实现快速检测及有效控制沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠杆菌, 也是肠杆菌科中最主要的食源性致病菌。据有关资料统计由沙门氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所占比例已超过三分之二，2007年发生的“ 花生酱事件”以及 2008 年发生的“ 西红柿 事件”等[1]沙门氏菌中毒事件的发生也使得食品中沙门氏菌的检测受到人们的普遍关注。本文主要是对食品中沙门氏菌的传统检测方法以及后续建立的以分子生物学、免疫学、生物传感器和电化学为基础的快速检测方法进行了系统的综述，旨在为该致病菌的检测方法的研究应用提供一定的参考。
1、 传统的检测方法（国标法）
目前, 我国对食品中沙门氏菌的检测大多采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品样品进行检测，这种传统的培养方法可分为前增菌、增菌、分离培养、生化试验和血清学鉴定等步骤进行。虽然传统培养法可靠性高，但是其操作繁琐且耗时费力，并不能满足食品快速检测的要求。
2、分子生物学检测方法
2.1聚合酶链反应技术
PCR技术是一项敏感性高、特异性强且快速准确的微生物检测技术，也被许多学者用于对食品中沙门氏菌进行检测和研究。汪琦等[2]就采用传统培养方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 种方法对沙门氏菌进行检测。在常规PCR的基础上宋东晓[3]建立了检测食品中沙门氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技术也运用于食品中沙门氏菌的检测，钟伟军[4]通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法，此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
2.2核酸探针技术
核酸探针技术是根据核苷酸碱基互补的原理,在已变异的DNA样品中加入用同位素等标记的DNA特异片段，在一定条件下两片段进行杂交从而达到检测DNA的目的。此技术不仅简便、快速而且敏感性高、特异性强，已用于食品中沙门氏菌的检测。Almeida等[5]通过建立一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中沙门氏菌进行了检测，准确度高达 100%。
2.3基因芯片技术
基因芯片技术是利用已知核酸序列的探针与靶核苷酸序列杂交，然后通过信号检测对其进行定性与定量分析，在沙门氏菌等各种致病菌的分析检测中有很好的应用前景。饶宝等[6]通过建立检测致病菌的基因芯片检测方法，设计了通用引物和特异性探针: 沙门氏菌探针、大肠杆菌探针和金黄色葡萄球菌探针,实现了同时检测并区分沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的目的。祝儒刚等[7]运用多重 PCR 结合基因芯片技术建立了检测肉及肉制品中的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌等5种食源性致病菌的快速检验方法。
2.4噬菌体裂解技术
噬菌体有特异性裂解细菌的作用。张碧波等学者利用此技术进行沙门氏菌
快速检测，结果和其他学者相同，据此得出特异性噬菌体可以检测出沙门氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌体裂解对150份食品样品进行快速检测，结果说明肠杆菌科噬菌体组合对培养10h的沙门氏菌敏感性和特异性较高，这对实现沙门氏菌实时、快速而准确的检测有重要意义。
2.5环介导等温扩增技术（LAMP）
环介导等温扩增技术是2000年Notomi等开发的一种新的恒温核酸扩增方法,此方法的特点是特异性强、灵敏度高且简单、快速,适合对大规模样品的快速检测[9]。李佳桐[10]通过实验建立了沙门氏菌的LAMP检测方法,并将此方法与常规PCR进行比较,结果显示：LAMP方法对沙门氏菌的检测恒温65℃下只需要40min,只扩增沙门氏菌,不会扩增其他革兰氏阴性菌,最低可检出浓度10cfu/mL,比常规PCR的最低检出浓度高1个数量级,通过添加荧光染料SYBR Green Ⅰ,能够快速简便的观察检测出绿色的阳性结果十分明显的区别于橙色的阴性结果。
3、免疫学方法
3.1酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附法简称 ELISA， ,此技术敏感性高 ,不需特殊设备 ,结果观察简便，早在1977年就有报道将酶联免疫吸附法用于食品中沙门氏菌的检测。伍燕华等[11]设计捕获抗体和检测抗体，建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法对食品中的沙门氏菌进行检测。张帅等[12]建立双抗夹心ELISA体系，检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800CFU/g，等均并与其他血清型沙门氏菌、单增李斯特菌等菌均无交叉反应,特异性良好。
3.2免疫荧光标记技术
免疫荧光标记技术是根据抗原抗体的特异性反应，将荧光素标记在已知抗原(或抗体)上,与特异抗体(或抗原)结合后产生荧光，可用来定位抗原或抗体、并通过定量分析，确定测定含量。叶明强[13]基于纳米免疫磁珠富集,免疫量子点标记,建立了一种食品中沙门氏菌的含量进行快速检测的方法，研究出了一种新型的免疫荧光食源性致病菌检测技术。
3.3斑点免疫金渗滤法
免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物结合免疫原理的一种应用于抗原抗体的新型技术，该技术运用最广泛的就是斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技术对沙门氏菌的快速检测进行了研究，曹春梅等[14]是利用斑点免疫金渗滤法对沙门氏菌O9抗原进行了研究，结果表明此法简单、快速，适合推广运用；孔繁德等[15]是通过建立直接检测沙门氏菌的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒对该菌进行了研究。
3.4免疫磁性分离技术
免疫磁珠分离技术是将特定病原体的单抗或多抗与磁珠微球偶联，并通过抗原抗体反应形成磁珠，在外加磁场作用下磁珠会发生定向移动，从而达到分离目标病原体的作用。食品样品中致病菌含量很少，常规的方法是很难从中分离出来的，借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。王海明等[16]应用磁免疫技术建立快速检测食源性沙门氏菌的方法，结果表明此方法能对食品基质中的目标菌进行快速有效的富集,其检测限<10cfu/25g,检测周期约为40小时。胡霏[17]也通过实验针对鼠伤寒沙门氏菌建立免疫磁分离技术结合荧光层析技术的快速检测方法。
4、生物传感器技术
生物传感器是利用一些生物活性物质如酶 、多酶体系 、抗体等做为敏感器件，然后配以适当的信号传导器所构成的分析检测的工具。我国学者已采用此法对沙门氏菌的抗原、抗体的免疫吸附进行检测，并已用于快速检测食品中致病的沙门氏菌，而仅需 1h 完成，达到了快速的检测目的。宁毅[18]在对碳纳米管性质研究的基础上,结合分子探针构建了碳纳米管生物传感器，并将其用于沙门氏菌的检测，结果显示所构建的传感器灵敏度高、特异性强、稳定性好。
5、电阻抗技术
电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，因为具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点，目前此法已用于食品中沙门氏菌检测检验并已通过美国公职分析化学协会(AOAC)认可。陈广全等[19]建立了电阻抗法快速检测食品中沙门氏菌的方法，并将其与常规培养法进行比较，对食品中的沙门氏菌属进行检测,结果表明电阻抗法比传统培养法更加快速、可靠。
6、总结
综上所述，沙门氏菌检验技术正从传统的培养方法向分子检测方法改进，并向仪器化、标准化、自动化方向发展，并且食品安全、致病菌等问题对人类健康以及生活环境都造成了严重威胁，加强沙门氏菌检测势在必行。目前沙门氏菌快速检测技术大多具有检测迅速、灵敏度高、特异性强等特点，此外这些方法还具有各自的优点和局限性，在未来发展过程中需要我们不断改进和创新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙门氏菌快速检测技术。