gst检测方法

① gst 抗氧化

（1）根据对照原则，向A瓶接种正常细胞，B、C、D、E瓶接种等量的鼻咽癌细胞．
（2）从实验结果表格中数据可知，C、D、E瓶中分别加入GST溶液的浓度为5、10、15μmol/L，
（3）通过表格数据可知，实验中通过检测并统计细胞凋亡基因（Bcl-2基因和Bax基因）的表达来判断对细胞凋亡的影响．
（4）据表2可知，实验结果为检测并统计鼻咽癌细胞凋亡率．
从表一中数据可知，Bcl-2蛋白表达降低和Bax蛋白表达升高时，鼻咽癌细胞凋亡增加，故鼻咽和癌细胞凋亡Bcl-2蛋白/Bax蛋白的比值呈负相关．
从表二中数据可知，GST可诱导鼻咽癌细胞凋亡，且随着GST浓度增大，诱导凋亡效果增强．
癌细胞膜上的糖蛋白等物质减少，粘着性降低，易游离而从癌组织转移出去．
故答案为：
（1）等量的鼻咽癌细胞
（2）5、10、15
（3）细胞凋亡基因（Bcl-2基因和Bax基因）的表达率
（4）鼻咽癌细胞凋亡率
分析与讨论
①降低
②（GST）浓度
③糖蛋白

② gst pull down 技术详解

GST pull down技术原理：
先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST
pull down产物。这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可以用质谱鉴定出未知蛋白。

GST pull down实验流程：

③ 免疫共沉淀和GST pull down技术各有何优势

都是用来研究蛋白质相互作用的技术
免疫共沉淀的话蛋白质是处于天然状态，蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响，还可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
但是问题是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；而且必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，如果抗体选错了就没有结果。

GST pull-down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白结合。可以用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用，证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用。
但问题是这个方法可能会出现假阳性。也就是也许是因为电荷作用的影响造成的吸附，而不是生理性的相互作用。

④ GST pull down 实验细节问题求教

GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase) 分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。 GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。  实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离. 试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160） 实验操作程序： 材料及试剂 探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物
细胞蛋白裂解液，洗脱液： PBS及PBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl： 8g KCl： 0.2g Na2HPO4： 1.44g KH2PO4： 0.24g 加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！ PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃ （以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用） 1：原核融合蛋白A的获得 1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株 1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜 1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）.6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N 1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀 1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉 1.6：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用 2：真核融合蛋白B的获得
2.1：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染 xq 3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融 4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。 5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。 6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。 7：吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。 8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。 10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。 注意GST-pull down的对照问题。（以A-GST和B-6*His为例） 1. 跑SDS-PAGE时点一个 input的蛋白（即B-6*His） 用于做阳性对照 看一下western操作过程中，试剂，操作步骤有没有问题。 2. 谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白，input B-6*His，用于做阴性对照 看一下是否GST会与input的蛋白相互作用 Protocol for Immunoprecipitation or GST-pull down 1. Wash the cell monolayer once with cold PBS. 2. Treat the cells with 2mM 3,3’-/PBS at 4ºC for 25 min to crosslink the associated proteins. (optional) 3. Scratch off the cells, and spin down at 4ºC at 1000rpm for 5 min. 4. Decant the supernatant. 5. Resuspend the cell pellet in appropriate amount of IP-Buffer A, sonicate at 40%
output for 10 sec, and incubate the lysate at 4ºC for 45min. 6. Spin at highest speed at 4ºC for 5 min. 7. Recover the supernatant and detect protein concentration with Bradford Reagent (Bio-Rad). 8. Take 500ug proteins, mixed with 4 volume of IP-Buffer B. 9. Preclear the lysate by adding 1ug normal IgG and 5ul protein-G beads (Sigma), incubate on a rotator at 4ºC for 1hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST protein and 5ul glutathione-sepharose 4B beads instead. 10. Spin down the beads at 4ºC at 10000rpm for 3min. 11. Recover the supernatant, add 1ug specific antibody or normal IgG, and incubate on a rotator at 4ºC for 2hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST-fused specific protein or equal molar of GST protein instead. 12. Add 5ul of 5ul protein-G or glutathione-sepharose 4B beads, and incubate for another 2hr or overnight. 13. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. Caution: There will be some white pellets just above the beads on the tube wall, which are protein precipitates e to denature. Remove away these precipitates, otherwise they will give false binding band in both control and test groups, affecting the explanation of the results. Check this phenomena at every washing step. 14. Wash the beads with 1ml of IP Washing buffer on a rotator at 4ºC for 5min. 15. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. 16. Repeat step 14 and 15 for three more times. 17. Resuspend the pellet in 25ul 1xSDS loading buffer and incubate at RT for 30min. 18. Spin at 3000rpm at RT for 5min. 19. Recover the supernatant and put at –20ºC or subjected to SDS-PAGE running. 20. For the input control, 25ug protein will be included in gel running. Caution: to avoid the interference of IgG heavy chain with specific proteins with MW around 50KD, 1x SDS loading buffer without beta-mercaptoethanol or DTT can be used instead. At this condition, the interchain cysteine-cysteine bond will be maintained, giving IgG band at 100KD or so. IP-Buffer A: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl 1mM EDTA PH8.0 0.5% Triton X-100 plus Protease Inhibitors (Roche) IP-Buffer B: IP-Buffer A minus Triton X-100. IP Washing Buffer: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl

⑤ GST pull-down assay和免疫共沉淀的区别是什么

GST
pull-down一般指用一个带GST标签的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物。
免疫共沉淀一般是用某一蛋白的抗体，在细胞裂解液中与相应的蛋白结果，用Protein
A/G将抗原抗体复合物拉下，最后在拉下的复合物中检测目的蛋白的实验。
二者都是用于检测蛋白相互作用的实验。
区别是pull-down一般是验证
体外
相互作用；免疫共沉淀一般用于检测细胞水平的
体内
相互作用。

⑥ 免疫共沉淀和GST pull down技术各有何优势

免疫共沉淀的话蛋白质是处于天然状态，可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。

GST pull-down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白结合。可以用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用。

⑦ DNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些

DNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些
研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验。研究蛋白质/ 核酸相互作用近期采用的新技术有：核酸适体技术、生物信息学方法、蛋白质芯片技术以及纳米技术等。
（1） 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究
此法也可称为活细胞定位.把两种具有相互作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光
蛋白（绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）的载体中,共转染到功能细胞中（一般选用 COS7 细胞）表达带有荧光的融合蛋白.这样,相互作用的两种蛋白就被标上不同的荧光,可以在细胞内用荧光显微镜直接观测.在进行精确细胞定位或共定位时,必须用共聚焦荧光显微镜观测.因为共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的 CT）观测的是细胞内一个切面上的颜色.如果在一个切面上在同一区域看到两种颜色,就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用.普通荧光显微镜看到的是一个立体图象,无法确定蛋白质共定位现象.在进行定位或共定位同时,也可以对细胞核进行染色.这样,在细胞中就有三种颜色.细胞核的显色帮助你确定共定位发生的位置.上面介绍的活细胞定位,其优点是表达的荧光蛋白荧光强,没有背景,观测方便.但缺点
是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白,实际上是两个融合蛋白.融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布一致,有待于进一步确定.而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺点.
（2） 利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究
免疫荧光的原理是,首先把细胞进行固定,然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内
靶蛋白进行免疫反应,再用荧光素（如 FITC 和 TRITC 等）标记的二抗与一抗进行反应.这样就在细胞内形成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗）,结果靶蛋白被标上颜色,然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果.
免疫荧光技术最大优点就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用.当然也可以对
靶细胞进行转染表达目的蛋白,然后标记目的蛋白进行观测.免疫荧光技术的缺点是荧光相对较弱并且背景较高,结果受到干扰,所以这项技术不好掌握.为了结果的可靠性,要求严格设计阳性对照与阴性对照.
（3） 细胞内蛋白动态定位
有时细胞在正常状态下,有相互作用的蛋白在胞内可能暂时分开,没有共定位现象发生.
但是在某一个特定情况下,如细胞受到外界刺激时,细胞本身会产生应急反应,这时暂时分离的蛋白有可能发生相互作用,并产生共定位现象.所以在进行共定位研究时,可根据具体情况具体分析,必要时观测细胞内蛋白动态定位结果.

⑧ GST的中文解释是血液检查中的

GST是一种酶。
谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）：GST有三种同工酶（α、μ、π），其中GST-π可作为消化道恶性肿瘤的标志物。

⑨ 谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GST)在临床上有什么临床的检测意义

根据你的问题简洁回答一下:

第一.谷丙转氨酶（简称GPT、ALT）升高在临床是很常见的现象。肝脏是人体最大的解毒器官，该脏器是不是正常，对人体来说是非常重要的。GPT升高肝脏功能出现问题的一个重要指标。在常见的因素里，各类肝炎都可以引起GPT升高，这是由于肝脏受到破坏所造成的。一些药物如抗肿瘤药、抗结核药，都会引起肝脏功能损害。大量喝酒、食用某些食物也会引起肝功能短时间损害。
GPT主要存在于肝细胞浆内，其胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。但它并不具器官专一性，许多疾病都可以引起它的增高。明显升高见于急性病毒性肝炎，中度升高见于慢性肝炎、肝硬化活动期、肝癌、肝脓肿，心梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高。因此对GPT升高的评价应密切结合临床。部分GPT升高与脂肪肝、饮用酒精有关。临床常用的保肝药物较多。但有些药物治疗效果可以但容易反复，致使一些肝脏疾病长期不能治愈，大量的肝细胞遭受破坏。如何保护肝细胞，是保护肝脏功能的关键所在。

第二.谷草转氨酶在心肌细胞中含量最高，但肝脏损害时其血清浓度也可升高，临床一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。谷草转氨酶的正常值为0～40μ/L，当谷丙转氨酶(ALT)明显升高，谷草(AST)／谷丙(ALT)比值>1时，就提示有肝实质的损害。

⑩ gst pulldown 能证明两蛋白间是直接相互作用的吗

一、酵母双杂交系统：酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬菌体展示技术：在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cdna文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术：表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
四、荧光能量转移技术：荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白(GFP)的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。
五、抗体与蛋白质阵列技术：蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。
六、免疫共沉淀技术：免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPAPansobin”，因为SPAPansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
七、pull-down技术：蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。