山椒素的紫外分光光度检测方法

A. 紫外分光光度法的原理是什么

分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

(1)山椒素的紫外分光光度检测方法扩展阅读

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。在一定条件下，物质的吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。

当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定。

参考资料来源：网络-紫外-可见分光光度法

B. 紫外分光光度计怎么做检测限能具体怎么做的方案吗

你是要测啥目标物啊。是测DNA吗，可以做等比稀释，然后用浓度和吸光度作图，线性部分就是可检测浓度，S型曲线的两端就是检测范围的下限和上限

C. 紫外分光光度法测定药物含量的方法主要有哪两种

标准物质做吸收度的标准曲线，再测样品的吸收度，换算成浓度。有的测透过率。前者是主要的

D. 紫外分光光度法测木质素具体步骤

是想定性还是测含量？
定性的话比较简单，进行光谱扫描，进行图谱分析，定量的话就需要用标准物质在特征波长下做标准曲线了

E. 如何用紫外分光光度计，测量水中二甲苯的浓度（步骤）

分光光度计要测量的样品必须是均一的溶液，不能有沉淀，如果有沉淀的话就要摇匀。之于为什么这样做和可以做哪些测量、如何测量，下面详述:
分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。
而分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。 常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区,(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： 1 A=log — =ECL T 式中 A 为吸收度； T 为透光率； E 为吸收系数，采用的表示方法是(E1％ 1cm),即吸收度换算成溶液浓度为1％(g/ml)，液层厚度为1cm的数值； C 为100ml溶液中所含被测物质的重量，g(按干燥品或无水物计算）； L 为液层厚度 ，cm。 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计的简单原理
分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
蛋白质的直接定量（UV法）
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显着。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后1011分光光度计的重要配件—— 比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。
细菌细胞密度（OD 600）
实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。
分光光度计的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。
由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
随着科技的发展，现在比色杯已经不是使用分光光度计时的必备物品。目前国外Nanodrop公司（现已被Thermo Fisher公司收购）生产的ND1000分光光度计与旧式分光光度计相比，已经可以做到无需稀释样品，无需使用比色杯，每次测量仅需1-2μl样品即可完成测量。

F. 怎么用可见紫外分光光度计测定样品

第一步，知道你所需要测量物质的特征吸收波长是多少？这个可以在国家标准、行业标准或其他相关标准或方法。例如测量总氮的话，就需要220和275nm这2个波长，所以必须买紫外的光度计，并且最好带双波长测定功能，例如测总磷是697nm，只需买台可见光度计就可以了。
第二步，知道所测量的物质的实验方法，需要哪些仪器和设备，还有玻璃器皿等，同时还有比较完成测量所需要的所有化学试剂等。这个可以在标准或实验方法中找到，基本在互联网上都可以找到电子版的测量方法。
第三步，配置好所需测量物质的标准浓度溶液，一般是5-8个标准溶液，浓度建议从高到低，建议每个不同浓度贴上标签，以防顺序搞错。注意，部分实验需要往标准溶液中加显色剂之后才可以用光度计进行测量。
第四步，设置好光度计的测量波长，这就需要熟悉光度计的基本操作，一般测量物质的浓度都是用的标准曲线法，就是对应光度计中的定量测量功能。具体操作时第一步，把仪器的波长调整到我们所需要的波长，例如测量总磷直接把波长走到697nm，之后放入装好蒸馏水的比色皿到样品室做空白，就是熟称的调零。第三部把标准溶液放入样品室，依次测量他们的吸光度，仪器一般会自动记录之后就会给出标准曲线方程，实验完毕。如果仪器不能直接记录吸光度，可以先记在笔记本上，之后用excel软件进行计算标准曲线。判断做出的标准曲线是否能用，看哪个R值即那个相关系数，一般最少做出0.999就可以用了，差一点的仪器也可以做出0.99.
第五步，把未知样品放入样品室就可以直接测量出样品浓度。

G. 简述用紫外分光光度法定性鉴定方法有哪些

1、比对最大吸收峰的方法；
2、摩尔吸光系数的比对法；
3、比对吸收光谱曲线法。

H. 急求紫外分光光度法的详细操作步骤

一、原理

可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的可见紫外吸收光谱。基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。它是以朗伯──比耳定律为基础。

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朗伯—比耳定律 A = lg—- = ECL

T

式中 A为吸收度；

T为透光率；

E为吸收系数，采用的表示方法是（E１％１ｃｍ），其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度数值；

C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g；

L为液层厚度，cm。

二、使用范围

凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。

三、仪器

可见-紫外分光光度计。其应用波长范围为200～400nm的紫外光区、400～850nm的可见光区。主要由辐射源（光源）、色散系统、检测系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。

本仪器是根据相对测量的原理工作的，即先选定某一溶剂（或空气、试样）作为标准（空白或称参比）溶液，并认为它的透光率为100％（或吸收度为0），而被测的试样透光率（或吸收度）是相对于标准溶液而言，实际上就是由出射狭缝射出的单色光，分别通过被测试样和标准溶液，这两个光能量之比值，就是在一定波长下对于被测试样的透光率（或吸收度）。

本仪器可精密测定具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物、有色物质或在适当条件下能与某些试剂作用生成有色物的物质。

使用前应校正测定波长并按仪器说明书进行操作。

四、仪器的校正

1.波长的准确度试验

以仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间误差表示，应在±1.0nm范围内。

可用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正。

2.吸收度的准确度试验

3.杂散光的试验

4.波长重现性试验

5.分辨率试验

五、测定方法

1.对照品比较法

（1）按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算含量，即得。

（2）计算式

A样×G对/稀释倍数×100×1

含量（%）= ————————————-- ×100%

A对×G样/稀释倍数×100×1

2.吸收系数法

（1）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。

（2）计算式

A样

含量（%）= ——————————————- ×100%

G样/稀释倍数×(E１％１ｃｍ)对×100×1

3.计算分光光度法

采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显着影响，故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。若测定时不用对照品，如维生素A测定法，则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。

六、注意事项

1.空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。

2.测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。

3.在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。

4.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。

5.吸收池应选择配对，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于0.5％的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。

6.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。

7.仪器的接地必须良好，一切裸露的零件对地电位不得超过24伏（测电笔的氖管不得发亮）。

8.在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时，必须及时推入光门钮杆（使光电管前光门关闭），保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。

9.在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。

10.取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。

11.若吸收池内外壁沾污，两池差较大的处理。

（1）可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻摩擦，再用纯化水冲净。

（2）如上述方法处理不好，必要时可用重铬酸钾-硫酸洗液泡洗1～2分钟，用自来水冲净，再用纯化水冲净。

（3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光洁度受损影响正常使用。

12.请务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作，如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色，应立即更换。该仪器干燥剂筒有两个：一个是装在放大器暗盒上，另一个装在单色光器暗盒上。

13.在更换硅胶干燥剂时，应关闭切断电源。

14.在停止工作期间，主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器，并在防尘罩内放数袋防潮硅胶。

15.仪器在操作中，狭缝的宽度应从小逐渐开大。若狭缝过大，由于进入光电管的光能量强度过大，将会使放大器输出信号达到饱和，以至数字显示出溢出（即数字闪烁或示1不变）。这不是仪器有故障。

16.将波长旋转放在625nm，铗缝关闭在0.02nm附近，选择按键恢复在停止工作部位（即三个键均弹出）。

17.搬动仪器时应搬在主体端，不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室部位，以防止仪器狭缝或光路部件受力而发生变形。并在搬动或运输时，应将可动部分固定，如各旋钮可用胶布贴住，狭缝位置开大些，然后固定，不要关小狭缝，以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。

18.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭，否则将损坏仪器光学表面，增加杂散光。

19.仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，为保证测定的准确性请经常校准波长精度。如有异常，应立即报告质量保证部，但不得擅自调整，并及时做好记录。

七、结果计算

A

E１％１ｃｍ（供试品） = ——

CL

E１％１ｃｍ（供试品）

含量（%）= ——————————- ×100%

E１％１ｃｍ（标准值或对照品）

八、允许差

仪器分析方法的误差限度，除另有规定外，其相对偏差应在±(2.0～3.0)%。

( 来自网络博客)

I. 用紫外分光光度计如何确定检测波长

1、紫外分光光度计都自带波长自检功能，其原理是仪器内部利用已设定的氘灯或者钨灯的特征波峰与同样设定波长下波峰做比对，并根据内部设定值做修正。

2、紫外分光光度计，就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外分光光度计可以在紫外可见光区任意选择不同波长的光。物质的吸收光谱就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子 、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。

J. 紫外分光光度法

在实际测量中，采用在另一等同的吸收池中放入溶剂与被分析溶液的透射强度进行比较，即：A = lg( I溶剂/ I溶液) ≈ lg ( I 0/ I )吸光度具有加和性：A总λ= A1λ+ A2λ+ …Anλ比尔定律应用的局限性：只适用于稀溶液、化学偏离、仪器偏离
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4.2 紫外一可见分光光度计
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1. 光源功能：提供能量激发被测物质分子，使之产生电子光谱谱带（提供宽带辐射）。连续光源：广泛应用在吸收和荧光光谱中(气体放电光源) 氘灯、氢灯紫外可见氩灯真空紫外氙灯真空紫外、紫外、可见(热辐射光源) 钨丝灯、卤钨灯可见光区
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2. 单色器功能：从光源辐射的复合光中分出单色光。3. 吸收池功能：盛放分析试样（一般是液体）
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4. 检测器功能：检测光信号，测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。5. 信号显示系统
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6. 紫外一可见分光光度计的类型(1) 单波长单光束分光光度计缺点：测量结果受电源波动的影响较大，误差较大。
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(2) 单波长双光束分光光度计优点：除了能自动扫描吸收光谱外，还可自动消除电源电压波动的影响，减小放大器增益的漂移。
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(3) 双波长分光光度计优点：在有背景干扰或共存组分的吸收干扰的情况下，可以对某组分进行定量测定。还可以获得微分光谱和进行系数倍率法测定。
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(4) 多道分光光度计具有快速扫描的特点
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4.3 化合物电子光谱的产生4.3.1 有机化合物的紫外一可见吸收光谱（一） 跃迁类型在紫外可见光区范围内，有机化合物的吸收带主要由σ→σ*、n→σ*、π→π*和n→π*跃迁产生，其相对能量大小次序为：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*。
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σ∗π∗nπσσ σ∗σ π∗π σ∗n σ∗π π∗n π∗有机化合物分子中电子跃迁的能量
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σ→σ*跃迁：分子中的成键σ电子跃迁到σ*反键轨道上去，这是一切饱和有机化合物都可能产生的电子跃迁类型。n→σ*跃迁：分子中未成键的n电子激发到σ*轨道上去，所有含有杂原子的饱和烃衍生物都可发生这种跃迁。含有σ→σ*、n→σ*跃迁的化合物，如：饱和烷烃、卤代烷烃、醇、醚等是紫外可见吸收光谱测定时的良好溶剂。
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•π→π*跃迁：可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，其最大摩尔吸光系数εmax很大。•n→π*跃迁：发生在含有杂原子的不饱和化合物中，其最大摩尔吸光系数εmax比较小。•电荷迁移跃迁：当外来辐射照射某些化合物时，电子从体系具有给予体特性的部分转移到该体系具有电子接受体特性的部分所发生的跃迁。其谱带较宽，吸收强度大，εmax> 104。
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NR1R2NR1R2+-hυ电子接受体电子给予体CC+hυ电子接受体电子给予体OROR-
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（二）常用术语1. 生色团：分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。（含有π键的不饱和基团）2. 助色团：有些基团本身没有生色作用，但却能增强生色团的生色能力，即它们与生色团相连时，会使其吸收带是最大吸收波长发生红移，并且增加其强度。通常是带有非键电子对的基团。3. 红移和紫移：吸收带的最大吸收波长发生移动，向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为紫移。
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（三）有机化合物的紫外、可见光谱1. 饱和烃及其取代衍生物σ→σ*、n→σ*2. 不饱和烃及共轭烯烃σ→σ*、π→π*3. 羰基化合物n→σ*、π→π*和n→π*4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带5. 稠环和杂环
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4.3.2 无机化合物的紫外一可见吸收光谱（一）电荷迁移跃迁某些分子同时具有电子给体特性的部分和电子受体特性的部分。当电子从给体外展轨道向受体跃迁时就会产生较强的吸收，这样产生的光谱称为电荷迁移光谱。如在金属络合物中配位体具有电子给体的性质，金属离子为电子受体。电子从配位体轨道跃迁到中心原子的外层轨道，就可以产生电荷迁移光谱。
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（二）配位场跃迁1. f-f跃迁镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子所处的配位环境的影响。2. d-d跃迁过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
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4.3.3 影响吸收谱带的因素1. 分子结构的变化：（1）饱和化合物中引入生色团和助色团（2）配位体场的改变：八面体、四面体、正方平面等等
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（3）共轭效应和超共轭效应由于共轭后的电子的运动范围增大，跃迁所需的能量变小，所以由共轭作用产生的吸收峰波长值较大，同时吸收强度增大。共轭的不饱和健越多，红移现象就越显着。1,3—丁二烯在己烷中的λmax= 217nm，εmax = 21,000；1,3,5—己三烯在异辛烷中的λmax= 268nm，εmax = 43,000；1,3,5,7,9—癸五烯在异辛烷中的λmax= 334nm，εmax = 121,000。
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（4）空间位阻CH3CH3CH3H3C（a）（b）λmax(b) > λmax(a) 通常情况下，反式异构空间位阻小于顺式异构，其共轭体系共平面性比顺式结构好，跃迁能量较低，λmax较大。
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2. 溶剂效应溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。
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改变溶剂的极性还会使最大吸收波长发生变化：当溶剂极性增大时，由n→π*跃迁产生的吸收带发生紫移，而由π→π*跃迁产生的吸收带发生红移。
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3. 温度温度增高，分子碰撞频率增加，谱带变宽，谱带精细结构消失(热变色效应)。
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4.4 分析方法及其应用4.4.1 定性分析吸收光谱比较简单，特征性不强，并且大多数简单官能团在近紫外光区只有微弱吸收或无吸收，所以应用有一定局限性。但可用于鉴定共轭生色团，以此推断未知物的结构骨架，在配合其它结构分析方法时，是有用的辅助方法。
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（一）定性方法1. 比较吸收光谱曲线：形状、峰数、λmax位置与相应的εmax。2. 用经验规则计算λmax，然后与实测值比较。
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（二）经验规则Woodward规则：计算共轭二烯、多烯烃、共轭烯酮类化合物π→π*跃迁最大波长。
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Oαβδδ+1γδ+2母体环己酮215nm 同环二烯39nm 增加两个共轭双键60nm 一个β烷基 12nm一个环外双键5nm 三个γ+烷基54nm共计385nm
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AcOABCR母体同环二烯253nm增加两个共轭双键60nm三个环外双键15nm五个取代烷基25nm共计353nm
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4.4.2 定量分析（一）单组分定量方法1．校正曲线法2．标准对比法AS= k CSb AX= k CXb CX = CS AX/ AS
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（二）多组分定量方法A1A+ B= ε1Abc1A+ ε1Bb c2BA2A+ B= ε2Ab c1A+ ε2Bbc2B
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【例】以分光光度法测定合金钢中的锰和铬。称取1.000g钢样，溶解后稀释至50.00mL，将其中的Cr氧化成Cr2O72-，Mn氧化成MnO4-，然后在440nm和545nm用1.0cm吸收池测得吸光度值分别为0.204和0.860。已知ε440Mn= 95.0 L.mol-1cm-1，ε440Cr= 369.0 L.mol-1cm-1，ε545Mn= 2.35×103L.mol-1cm-1， ε545Cr= 11.0 L.mol-1cm-1。求此合金钢中Mn，Cr的质量分数。(MMn=54.94 g.mol-1MCr=52.00 g.mol-1)
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【解】 根据吸光度的加合性列出联立方程：A440 = A440Mn+ A440Cr=ε440Mnb cMn+ ε440Crb cCrA545= A545Mn+ A545Cr=ε545Mnb cMn+ ε545Crb cCr即0.204 = 95.0 × 1 × cMn+ 369.0 × 1 × cCr0.860 = 2.35×103 × 1 ×cMn+ 11.0 × 1 ×cCr解得cMn= 3.64×10-4 mol.L-1cCr= 4.59×10-4mol.L-10.10%100%1.00054.941050103.64(Mn)－3－4=×××××=ϖ0.24%100%1.000252.001050104.59(Cr)－3－4=××××××=ϖ
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（三）双波长法1. 等吸收波长法A1 = A1A+ A1BA2= A2A+ A2BΔA = A2 - A1= (A2A- A1A) + (A2B-A1B) 由于A2B= A1BΔA = A2A- A1A= (ε2A- ε1A) bc
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2. 系数倍率法该式表明，信号S只与被测组分的吸光度值有关。λλλλλλλλλλ−==−==−−+=−=λλ用差分放大器可获得混和试样在波长λ2和λ1处的差示信号S
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3. 测定浑浊试样在双波长法测定中，若将λ2设在试样的吸收峰上， λ1设在试样无特征吸收的波长上，此时， λ1和λ2的背景吸收应相等。用双波长法测得两处吸光度的差值即可消除背景吸收，进行定量分析。
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（四）导数分光光度法对吸收光谱曲线进行一阶或高阶求导，即可得到各种导数光谱曲线。优点：1. 能够分辨两个或两个以上完全重叠或以很小波长差重叠的吸收峰2. 能够分辨吸光度随波长急剧上升时所掩盖的弱吸收峰3. 能够确认宽阔吸收带的最大吸收波长，分辨率随导数阶数的增加而增加，信噪比随着导数阶数的增加而减小。
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定量分析：（可提高检测的灵敏度）Aλ= ελbc，对波长λ 进行n次求导，只有Aλ和ελ是波长λ的函数，于是有：可见n次求导后，吸光度值仍与吸收物的浓度成正比。bcdddAdnnnnλλλλε=
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4.4.3 紫外一可见吸收光谱的应用1. 相对分子质量的测定M = εmb/A m：样品重量在紫外、可见吸收光谱法中，只要化合物具有相同生色骨架，其吸收峰的λmax和εmax 几乎相同。因此，只要求出与待测物有相同生色骨架的已知化合物的ε值，就能求出欲测化合物的相对分子质量。
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2. 测定平衡常数例 用分光光度法测定以下反应的平衡常数ZnL22-的λmax为480nm，该处的εmax＝3.00×103 L.mol-1.cm-1， Zn2＋和L2－在480nm处无吸收。用1.00cm的吸收池测得含2.30×10－4mol L－1 Zn2＋和5.00×10-4mol L－1 L2－溶液的吸光度为0.540。试计算平衡常数。−−+⇔+22222ZnLLZn
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解[][ ][][ ][][][ ][ ]().11040.11000.51080.1K1040.11080.121000.521000.51080.11030.21080.100.11000.3540.022×=××××=⋅×=××−×=+=⋅×=×−×=−=⋅×=××=ε=−−−−+−−−−−−−−−−−−+−−−−+＝则平衡常数为
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3. 结构分析例如，乙酰丙酮存在酮式和烯醇式两种异构体在极性溶剂水中，以酮式异构体为主，形成分子间氢键，λmax为277nm；在非极性溶剂己烷中，以烯醇式异构体为主，形成分子内氢键，λmax为269nm。
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4. 氢键强度的测定[例] 丙酮 n→π* 的吸收带水（极性）265.4 nm 即452.96 kJ.mol-1己烷 (非极性) 279.0 nm 即429.40 kJ.mol-氢键强度452.96 - 429.40 = 23.56kJ.mol-1
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思考题1.简述紫外可见吸收光谱的产生。2.朗伯－比尔定律及其数学表达。3.光源的主要作用是什么？4.各种类型紫外可见分光光度计的特点。5.有机化合物的吸收带主要由哪几类跃迁产生？6.影响吸收谱带的因素有哪些？7.用Woodward规则计算计算共轭二烯、多烯烃、共轭烯酮类化合物π→π*跃迁最大波长。8.多组分定量方法以及双波长法，导数法的特点9.紫外可见吸收光谱法的应用