⑴ 关于miRNA检测肺癌的一些小问题~非常感谢！
而恶性肿瘤形成过程可影响miRNA 肺癌诊断和治疗中的最新研究进展做一综述。 形成过程中的一些组合成分
⑵ 表达miRNA一般采用什么方法如通过质粒转录得到pri-miRNA还是pre-miRNA
质粒或者mimics转染都可以 要稳定表达的话就用质粒构建病毒载体 连进质粒的序列pri或者pre多可以 一般是连pre再像两边延长一点 大概200bp吧
⑶ microRNA的检测内容都有什么
乳腺癌：乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤，全世界每年约有120万女性发病，约有50万女性死于乳腺癌。乳腺癌的高发年龄多在25~64岁为多见。
宫颈癌：宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。中国每年新发现的病例为13.15万，多发群体为40~60岁女性。
卵巢癌：卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，死亡率为各类妇科肿瘤的首位。约70%以上的卵巢恶性肿瘤确诊时已经属于晚期，五年生存率仅25%~30%。卵巢癌发病年龄范围也是妇科肿瘤中最宽泛的，可以发生在女性一生中任何时期。
⑷ 检测mirna与dna序列直接作用用什么方法
microRNAs（miRNA）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNA）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA接到的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中发现的lin－4和let－7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。
miRNA有高等生物基因组编码,通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。其在物种进化总相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中其多种作用。
microRNAs的作用机制
miRNA是一类多细胞动物或植物基因组的前体mRNA内含子，miRNA独立转录单位或miRNA基因簇编码的19-25个核苷酸大小的内源性单链RNA，他们在转录后水平沉默特定基因从而对生物体基因表达起到精细调节的作用[1]。绝大多数miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成较长的茎环结构，称为初级miRNA（primary miRNA ,pri- miRNA）。pri- miRNA在Drosha-DGCR8复合体的作用下形成长度约60-70个核苷酸的发夹状RNA，成为前体miRNA（precursor miRNA,pre-miRNA)。随后，pre- miRNA在Exprotin－5复合物[2]的作用下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为miRNA复合体， miRNA复合物（RNA－inced silencing comlex，RISC）[1]与该miRNA的3’翻译区（3’UTR）结合到位于胞浆的P－body（processing bady）中[3]：如果miRNA与靶mRNA匹配完全，则该复合体降解mRNA；若两者序列部分匹配，尤其是miRNA的5’端2-8个被称为种子序列（seed sequence）的核苷酸与靶mRNA匹配完好，则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因。此外，某些miRNA，如miRNA－16能够特异结合于某些基因3’UTA的富含AU元件（AU rich element,ARE）,指导Ago等组成RISC区的蛋白与TTP结合，从而改变相应mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解。
此外，miRNA也可能抑制5’UTR含有内部核糖体进入位点（intrnal ribosome entry sites,IRESs）的靶标分子[4]。
miRNA的表达调控机制
①顺时调控元件 大多数miRNA基因的核心启动子区域含有TA盒，并且含有影响miRNA表达的细胞特异转录调节元件。miRNAs作为转录因子重要的靶分子在细胞功能调控中发挥核心作用。
②表观遗传学 最近一些研究提示，表观遗传学变化会影响miRNA 基因，从而调节miRNA表达。分析基于miRNAse（release 8.0）数据库的332个人miRNA基因序列时，发现其中155个miRNA的基因序列上游或下游2000bp处含有CG岛在miR-127[6],miR-24a[6],let-7a-3[7]和miR－370[8]基因中，均含有CpG岛，并且在相应地肿瘤组织中呈现高度甲基化，这些miRNA在肿瘤中的甲基化沉默将导致他们的靶基因－原癌基因（BCL6，CDK6和MAP3K8等）的表达，从而促进肿瘤发育。转录因子PRDM5可能参与了调解miRNAs基因的表观遗传学变化。在HEK293细胞中，PRDM5可以募集蛋白甲基化转移酶G9a和一类组蛋白去乙酰基酶等组蛋白修饰到has－mir－135b基因的启动子区域，行使抑制功能[9],miRNA在癌症细胞中的表达一般低于正常组织细胞，这表明多数miRNAs可能作为肿瘤抑制因子而发挥作用。原癌基因的低度甲基化和肿瘤抑制基因的高度甲基化被认为是癌症表观遗传学的主要决定因素。miRNAs基因在肿瘤中的异常甲基化使表观遗传学调控癌症机理更加复杂。
③单核苷酸多态性 存在于pri－mRNAs，pri－mRNA或成熟miRNAs基因序列中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）能够潜在地影响miRNA调节的细胞功能网络。miRNA基因或靶结合位点及其临近靶位点区域的多态变化时，于miRNA的生物合成及靶位点选择和抑制效应据重要的意义。
④RNA编辑 （RNA editing）是基因在初级转录物上增删或取代某些核苷酸而改变遗传信息的过程，从而可调节基因的表达。RNA编辑在miRNA调控基因默过程中其重要作用，不仅影响miRNA表达，而且影响特异miRNA的靶向分子的调控。此外，At编辑也有可能存在于靶分子的种子互补区域。
⑸ 检测肿瘤细胞中某一种miRNA比如miR-183，需要用到哪些试剂盒怎么做呢
不用哪些。。。买个锐博的miRNA检测试剂盒就行了 100次的才两三百 非广告 只是我只用过他们家的 别的公司应该也有 当然提RNA 反转录啥的也是需要各种试剂啦
⑹ 如何用qrt-pcr检测mirna的表达水平
miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。
最近的研究表明它们影响了约三成的基因。
miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。
同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。
⑺ 求助检测miRNA的半衰期和稳定性的方法
药物制剂的稳定性问题可以归纳为以下三方面。
（一）化学方面药物与药物之间或药物与溶剂。附加剂，形剂、容器、外界物质（空气、光线、水分等）杂质（夹杂在药物或附加剂等之中的金属离子、中间体、副产物等）产生化学反应反而导致药剂的分解。
（二）物理学方面例如乳剂的乳析、分裂、混悬剂中颗粒的结块或粗化，某些散剂的共熔，芳香水剂中挥发性油挥发逸散、片剂在贮藏中崩解性能的改变，浸出制剂的发等使药剂的原有质量变差甚至不合，医药使用要求。一般而言，物理方面的不稳定性部问题仅是药物的物理性质改变，但药物的化学结构不变。
（三）生物学方面由于微生物的滋长，引起药剂发霉、腐败或分解。由于上述原因，往往引起下列一种或向种后果：①产生有毒物质。一旦发现这种情况，药剂就应停止使用；②使药剂疗效减低或副作用增加。这种情况比较多见；③病人使用不变，如混悬剂中的药物沉淀成硬饼状，使用时不仅不便而且可能造成每次剂量不准确；④有时虽然药物分解的理极少，药剂的药疗效，含量、毒性等可能改变不显着，但因为产生较深的颜色或少量的微细沉淀（例如注射液），因而不能供药用。本章主要讨论药物水溶液的由于化学变化不稳定性及其克服的方法。，对化学动力在药物制剂稳定性试验中的应用，也作了初步介绍。有些无机药物水溶液的稳定性也很差（如漂白粉、碘化、过氧化氢等），但反应比较简单，常用的制剂也不多，所以本章中不予叙述。
⑻ 如何预测和鉴定miRNA的靶基因
免疫沉淀
当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通 www.ebiotrade.com
目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。
Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通
整个过程大致如下：
1. 创建miRNA模拟物。生物通 www.ebiotrade.com
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞，并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。生物通 www.ebiotrade.com
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物（其中包括靶标mRNA）进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA，鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后，细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞，它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样，研究人员只需投入很少，就能实现大范围的筛选。
靶基因的验证
预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 www.ebiotrade.com
目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先，构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，并改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。
目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶（luc2）作为主要报告基因，其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合；海肾荧光素酶/新霉素基因（hRluc-neo）作为对照报告基因，既能实现归一化处理，又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。
就目前而言，预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少，但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展，这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。（生物通 余亮）
⑼ 如何从提取的RNA中筛选出miRNA
是否是已知的miRNA？
如果是已知的miRNA，我建议你到Sanger网站检索一下序列，然后合成相应探针进行NorthernBlot确证，或者利用RT-PCR克隆相应片段进行测序，等等，具体用什么检测方法要取决于你的课题需要。（引用，仅供参考）
⑽ 如何筛选目的基因的miRNA
提取总DNA进行PCR只有mRNA可以PCR，其他的自然被淘汰了