国标检测总大肠杆菌的方法

1. 大肠杆菌检测方法国标是用什么方法检测的

大肠杆菌检测方法分为三种：

1、细菌分离鉴定法

分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液先经肉汤增菌，然后转种血琼脂平板。其他标本同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。

37℃孵育18～24小时后，观察菌落涂片染色镜检。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要的时候检定肠霉毒素。

2、卫生细菌学检查法

大肠杆菌会不断随粪便排出体外，污染周围环境水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，则表示样品被粪便污染的越严重，表明样品中存在肠道致病菌的可能性也就越大。

大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群，瓶装汽水和果汁中每100ml大肠菌群不能超过5个。

3、全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测法

全自动微生物定量分析（TEMPO）仪大肠杆菌群计数检测有TEMPOTC和TEMPOCC两种方法。

TEMPOTC的开发是为获得NF ISO4832标准相当性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO仪器上根据BAM方法专门用于24h计数食品中大肠杆菌群方法。

(1)国标检测总大肠杆菌的方法扩展阅读：

大肠杆菌在生物技术中的应用

这些菌株由于失去了细胞壁等重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。

生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。

真核基因在大肠杆菌中表达，必须有合适的表达载体(Vector),常用载体：pBV220,pET系统。

目的基因在大肠杆菌中表达的情况：

大肠杆菌更适合原核基因的表达，外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的，外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡，单个细胞的产量又与外源基因拷贝数，基因表达效率，表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。

2. 乳品中大肠杆菌检测国标GB/T4789.38-2008的具体步骤及达标的标准

第一法大肠杆菌MPN 计数

操作步骤
6.1、 样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品：以无菌操作取259 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r / min ～1000r/ min 均质1 min～2 min ，制成l:10 样品匀液，或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1mol/L 盐酸（HCI）调节。
6.1.4、 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3 管月桂基磺酸盐胰蛋白陈（LST ）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）。36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h～48h 内产气的LST 肉汤管数。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环分别从所有培养48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中取培养物1 环，移种于已提前预温至45 ℃ 的EC 肉汤管中，放人带盖的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h ，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h ±2h 。记录在24h 和48h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。
6.4、 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃ 培养18h～24h 。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
6.5、 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃ ，培养18h～24h 。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
6.6 、生化试验
6.6.1、 靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36 ℃±1℃ 培养24h±2h 后，加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL～0.3 mL ，上层出现红色为靛基质阳性反应。
6.6.2 、MR -VP 试验：将培养物接种MR -VP 培养基，36 ℃ ±1 ℃ 培养48h±2h 。移取培养物1mL至13 mm×100mm 试管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h ，如出现伊红色，为VP 试验阳性。
将MR 一VP 培养液的剩余部分再培养48h 后滴加5 滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
6.6.3、 柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koser 氏柠檬酸盐肉汤，36℃±1 ℃ 培养96h±2h,记录有无细菌生长。
6.7、 大肠杆菌MPN 计数的报告
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋- -或-＋- -。只要有1 个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST 肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST 肉汤阳性管数查MPN 表，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌MPN 值。

第二法大肠杆菌VRB - - MUG 平板计数法

8、样品稀释
按6.1 进行。
9、 检验
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1 mL 注人两个无菌平皿。另取1 mL 稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。将45 ℃±0.5 ℃ 的VRB 琼脂10 mL～15 mL 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG 琼脂覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃ 培养18h～24h 。选择菌落数为10～ 100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG 阳性菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 ）和产气肠杆菌（如ATCC 13048 ）做阳性和阴性对照。

10、 大肠杆菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。

第三法大肠杆菌PetrifilmTM 测试片计数法

12、 样品稀释按6.1 进行。
13、 检验
13.1、 接种和培养
选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，。揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml匀液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，将压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样品匀液均匀覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20 片，36℃±1 ℃ 培养。肉、家禽和水产品，培养时间为24h±2h；其他食品，培养时间为48h±2h 。
13.2、 判读
可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。 14 大肠杆菌测试片计数的报告
选择菌落数在15～150 之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。
如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1 乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150 ，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 ，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20 cm " ）。

这里可以下载此标准http://www.51zbz.com/biaozhun/134141.html

3. 大肠杆菌检测国家标准

法律分析：大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。 中国卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群，瓶装汽水和果汁中每100ml大肠菌群不能超过5个。

法律依据：《中华人民共和国食品安全法》 第四条 食品生产经营者对其生产经营食品的安全负责。食品生产经营者应当依照法律、法规和食品安全标准从事生产经营活动，保证食品安全，诚信自律，对社会和公众负责，接受社会监督，承担社会责任。

4. 大肠杆菌与大肠菌群检测方法

进入无菌室步骤
1． 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。
2． 关灯后0•5小时后放可进入。
3． 进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤
1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）
2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。
3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）
4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）
5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液
7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）
8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）
10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）
11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成
－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成
－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样
12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）
13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中 ，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14， 再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）
15， 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。
16， 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。

5. 大肠杆菌国标检测方法

sn/t0169-2010?