Ⅰ 请教流式细胞的具体实验步骤是怎样的
一、流式细胞术检测细胞表面标记的具体步骤如下：
1. 将试剂平衡至室温，并准备实验环境：清洁消毒的工作台面、适当的个人防护装备（工作服、帽子、口罩和手套），以及必要的实验耗材（棉签、草纸和含有消毒剂的有盖垃圾桶）。
2. 准备实验管并编号，例如：1号管加入IgG1抗体，2号管加入CD4/CD8抗体，3号管加入CD14/CD45抗体，4号管则作为对照。
3. 在每支试管中加入相应抗体10μl，然后加入50μl全血样本，轻轻震荡混合后，室温下避光反应20分钟。在加入抗体前需确保血样充分混匀。
4. 向每管中加入1ml溶血素，震荡后室温避光10分钟。
5. 离心处理（1200转，5分钟），弃去上清液，然后轻震荡。
6. 加入2ml PBS洗液，震荡混合后再次离心（1200转，5分钟），弃去上清液，轻震荡。
7. 加入PBS 900μl，并在上机前置于4°C保存。
8. 准备流式细胞仪进行检测。
二、细胞内细胞因子检测的详细步骤如下：
1. 准备实验环境：清洁消毒的工作台面、适当的个人防护装备，以及必要的实验耗材。
2. 准备实验管并编号，例如：IgG1/CD8/CD3和IFN-gamma;/CD8/CD3。
3. 在超净工作台内稀释PMA（1∶100）、BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS作为稀释液。
4. 取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1×10^6）50μl/管，加入50μl RPMI1640稀释一倍，然后加入刺激剂PMA、离子霉素和BFA，混匀。确保全血中的最终浓度为PMA: 50ng/ml、离子霉素：1μg/ml、BFA：10μg/ml。
5. 将细胞混合物在37℃，5% CO2条件下孵育4小时（最好在培养箱中进行，轻柔地盖上培养箱盖）。
6. 向各管中加入相应表面抗体20μl和激活的全血100μl，混匀后室温避光20分钟。
7. 加入2ml溶血素，室温避光10分钟，然后离心（1200转，5分钟），弃去上清液。
8. 加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟，然后加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃去上清液。
9. 向管中加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20μl，混匀后室温避光30分钟，然后加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃去上清液。
10. 加入PBS 500μl。在上机前置于4°C保存。
11. 准备流式细胞仪进行检测。
注意：本实验室提供流式细胞检测服务或流式细胞仪操作培训。新手可前来学习。本实验室为三甲医院科研共享平台，开放的实验服务包括流式细胞术、荧光定量PCR、ChIP免疫沉淀、Western blot、细胞培养和细胞株等。
Ⅱ 用流式细胞术(FCM) 检测大鼠盲肠肠壁组织中T淋巴细胞CD3+、CD4+ 、CD8+ 数量及CD4+/CD，具体步骤怎么做
1.将肠壁组织研磨为单细胞悬液，用PBS悬浮，并用300目尼龙网过滤；
2.按BD试剂说明书，加试剂、染色制备好标本（如果要进行绝对计数，则需要绝对计数管）；
3.按流式细胞仪操作要求，设定好相应模板，上机检查；
4.根据分析要求，用相应的分析软件、分析模板进行分析数据。
Ⅲ 如何分析流式细胞仪检测t淋巴细胞亚群结果
最常见的是分析CD4， CD8亚群。
先在FSC， SSC散点图上划出淋巴细胞gate。然后在此gate基础上选取T细胞标志染色阳性的细胞群（一般是CD3）。在把CD34阳性的细胞根据CD4 和CD8染色情况形式为散点图，得到CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, 以及双阳性的比率。如果还有其他细胞标志的染色，再进一步分析。