A. 大肠杆菌与大肠菌群检测方法
进入无菌室步骤
1． 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。
2． 关灯后0•5小时后放可进入。
3． 进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤
1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）
2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。
3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）
4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）
5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液
7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）
8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）
10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）
11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成
－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成
－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样
12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）
13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中 ，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14， 再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）
15， 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。
16， 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
B. 食品卫生微生物学检验.大肠菌数测定
微生物
一、大肠菌群的检测GB4789.3-2010
第一法 大肠物宽察菌群MPN计数法 第二法 大肠菌群平板计数法
1.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤:称取35.6g溶于1000ml蒸巧拆馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15min后备用。双料除蒸馏水外其他成分加倍。
1.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤：称取30g溶于1000ml蒸馏水中分装 ，经115℃15min高压灭菌备用。
1.3无菌生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1L蒸馏水中。分装于250ml的锥形瓶中，121℃高压灭菌15min后备用
1.4结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：称取41.6g溶于1L蒸馏水中，充分摇匀，加热煮沸2min冷却至50℃，倾注平板。
无菌 1 mol/L NaOH：称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
无菌 1 mol/L HCl：移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。
二、大肠菌群的检测GB4789.3-2003 第一法 大肠菌群MPN计数法
2.1称取乳糖胆盐发酵培养基35.0g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，115℃高压灭菌15min后备用。双料除蒸馏水外其他成分加倍。
2.2伊红美蓝琼脂平板：称取伊红美蓝琼脂37.5g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装、115℃高压灭菌15min后备用。
2.3乳糖发酵管：称取乳糖发酵培养基35.0g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，115℃高压灭菌15min后备用
2.4无菌生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1L蒸馏水中。分装于250ml的锥形瓶中，121℃高压灭菌15min后备用
2.5革兰氏染色按GB/T4789-2003中罩茄2规定。
C. 食品中的大肠杆菌的检测方法
培养基配置
检样、稀释
乳糖胆盐发酵管观察：（36摄氏度24小时）
3.1不产气 大肠杆菌阴性
3.2产气伊红美蓝琼脂倒平板
3.2.1G染色,G阳性,说明大肠杆菌阴性
3.2.2乳糖发酵管（36摄氏度24小时）,同样不产气,大肠杆菌阴性
D. 大肠菌群测试片接种
在进行食品大肠菌群测试时，通常选择1至2个不同浓度的样品进行检验。对于含菌量较低的液体，如饮用纯水和矿泉水，可以直接取样原液检测。首先，准备一片大肠菌群测试片，将其放置在实验台的平滑表面。接下来，揭去测试片的上层膜，确保操作区域无菌。然后，使用无菌吸管吸取1毫升样品溶液，将其垂直滴加到测试片的中心位置。在添加样品后，缓缓盖回上层膜，以防产生气泡。紧接着，使用压板，确保其平面部分朝下，将其定位在测试片中央，轻轻按下，使样液均匀地覆盖在圆形培养区域内，切记不要旋转压板。完成操作后，保持压板位置静置至少一分钟，让培养基充分凝固。[4]
E. 食品中大肠菌群的检验，有哪些需要注意的实验步骤
食品微生物学检验 大肠菌群计数：大肠菌群平板计数法（GB 4789.3-2010）
一 试剂和仪器
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB肉汤）
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
恒温培养箱
自动稀释仪
均质器
振荡器
二 样品处理
固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例，取密封状态良好的试样，备用待测。
三 检测过程
实验前准备
进入无菌操作室前应更换无菌实验服，戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后，首先用镊子夹取适量酒精棉全面擦拭双手，然后才能进行实验操作。
酒精易燃，因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离，防止出现危险，待手上的酒精挥发完全后，再进行实验操作。
样品的稀释
取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上，用酒精棉充分擦拭样品袋，将剪刀置于酒精灯外焰上充分灼烧，小心剪开样品袋。将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻，准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻，在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋，将均质袋放入拍击式均质器中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
注意：样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时可用1 mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。
均质完毕后，做好标记，将均质袋置于样品框中。
在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记，用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。同理，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不得触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
接种及培养
在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。
用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL，加入到培养皿中，备用。同理，加入1:100稀释液和空白液。注意，每个稀释度应接种2个无菌培养皿，空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。
加完样品梯度稀释液后，即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL～20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中，小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内，防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上，且倾倒过程应果断，防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜，不能过高或过低，温度过高不利于操作且对菌体有害，温度过低培养基迅速凝固，菌体不能在培养皿内均匀的分布，导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀，防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。
倒完培养基后，静置培养皿，等待培养基冷却凝固。
待培养基凝固后，再加3mL～4mL 结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是：使菌体均在培养基内部生长，以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后，翻转平板，置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h～24h。
平板菌落计数
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落，其中典型菌落的特征为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实实验
先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内，振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，于36℃±1℃条件下培养24h～48h。培养完毕后，观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者，即可报告为大肠菌群阳性。