蛋白质还有哪些检测方法

⑴ 实验室测定蛋白质分子量的方法有哪些

测定蛋白质分子量的常用方法：

粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳、渗透压法、质谱法包括电喷雾离子化质谱技术和基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速离心法）。

1、粘度法

一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为：

8、电喷雾离子化质谱技术

电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS 测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。

优缺点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。

9、基质辅助激光解吸电离质谱技术

基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。基体的作用在于保护待测物不会因过强的激光能量导致化合物被破坏。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。

优缺点：（1）同ESI-MS 一样对样品的消耗很少；（2）随着质量分析器的不断改进、新的基质的不断发现和应用以及延迟萃取技术的使用，使得MALDI-MS 的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS；（3）MALDI-MS 单电荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；（4）MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广的。

⑵ 检测蛋白质的方法

检测蛋白质的方法如下：

1、凯氏定氮法：准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，向1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物。

再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏。全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。

人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

⑶ 三种常用的蛋白质浓度测定方法

检测蛋白质浓度，尽管看似简单，但其中的机理却颇为复杂。为了帮助大家正确选择并轻松操作，以下是三种常用蛋白质浓度测定方法的原理及注意事项。

BCA（Bicinchoninic Acid）法

BCA法是近年来的热门蛋白质定量方法。其原理是，在碱性环境下，蛋白质与二价铜离子结合，还原为二价铜离子，随后BCA与一价铜离子结合形成稳定的蓝紫色复合物。该方法在562 nm处有较高的吸光值，与蛋白质浓度呈正比。不过，操作前需制作标准曲线。BCA法灵敏度高、操作简单，适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，但若溶液中含有与铜离子反应的螯合剂或还原性试剂，结果将受影响。此外，检测结果还会受到蛋白质内半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸含量的影响。

Bradford法

Bradford法由Bradford于1976年建立，其原理是带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。该方法在595 nm处有吸收峰，与蛋白质浓度呈正比。在使用Bradford法时，需注意以下事项：

1. 制作的标准曲线并非直线，需将待测蛋白质浓度稀释或浓缩至线形部分方可计算。

2. 高浓度去垢剂会影响Bradford法的准确性。可从BioEngX分享的protocol中了解干扰试剂及其浓度。

3. 可利用除595 nm以外的波长进行检测，但需注意斜率和最低检测限的变化。

紫外分光光度法

紫外分光光度法是一种简单但不可靠的方法。通过测量蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280 nm处的吸光值来估测蛋白质含量。该方法根据Beer-Lambert定律计算，但存在两个问题：不同蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量不同，且会受到核酸等物质的影响。尽管如此，该方法操作简单迅速，多用于纯化蛋白质的微量测定。