㈠ 外泌体还可以这样研究吗
外泌体的提取主要包括以下几种方式。
一是超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法 。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块， 由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种 方法得到的是微泡不是外泌体 。
二是过滤离心， 这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性 ，但同样存在纯度不足的问题。
三是密度梯度离心法， 用此种方法分离到 的外泌体纯度 高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
四是免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态 的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH 和非 生理性盐浓度会影响外泌体生物活性， 不便进行下一步的实验 。
五是PS亲和法，该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9 nature杂志发表了该方法最新数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。
六是色谱法，这种方法分离到的外泌体在 电镜下大小均 一， 但是需要特殊的设备 ， 应用不广泛 。
㈡ 外泌体标志物怎么选择鉴定
外泌体标志物的选择鉴定是外泌体研究中的关键环节，以下从标志物类型及选择依据、鉴定方法等方面进行介绍：
常见外泌体标志物类型
膜蛋白标志物
CD63：属于四次跨膜蛋白超家族，在多种细胞来源的外泌体表面高度表达，常被用于外泌体的鉴定和分离。
CD81：也是四次跨膜蛋白，参与细胞间的相互作用和信号传导，在不同细胞分泌的外泌体中广泛存在。
CD9：同样是四次跨膜蛋白家族成员，与外泌体的生物发生和功能调节有关，可作为外泌体的通用标志物。
细胞质蛋白标志物
GAPDH：作为一种糖酵解途径中的关键酶，在细胞内广泛存在且含量相对稳定，常被用作内参蛋白，也可作为外泌体的标志物之一。
热休克蛋白（HSP）：如 HSP70、HSP90 等，参与蛋白质的折叠、转运和降解，在应激条件下，外泌体中 HSP 的表达会发生变化，可作为外泌体的特征性标志物。
脂质标志物
神经酰胺：是外泌体膜的重要组成成分，在维持外泌体膜的结构和功能方面发挥重要作用，其含量和组成可作为外泌体鉴定的指标之一。
磷脂酰丝氨酸（PS）：正常情况下位于细胞膜内侧，在细胞凋亡或外泌体形成过程中，PS 会外翻到细胞膜外侧，可作为外泌体的一个特征性标志物。
选择依据
特异性：理想的标志物应在目标外泌体来源的细胞或组织中特异性表达，而在其他细胞或组织中表达量极低或不表达，这样可以准确地识别和鉴定目标外泌体。
稳定性：标志物在不同的生理和病理条件下，以及在不同的实验处理过程中，都应具有良好的稳定性，能够可靠地反映外泌体的存在和特征。
丰度：标志物在目标外泌体中的表达量应相对较高，以便于检测和分析。高丰度的标志物可以提高检测的灵敏度和准确性，减少假阴性结果的出现。
功能相关性：选择与外泌体的生物发生、分泌、摄取或功能相关的蛋白质作为标志物，不仅可以用于外泌体的鉴定，还可以为研究外泌体的生物学功能提供线索。
鉴定方法
免疫印迹法（Western blot）：利用抗原与抗体的特异性结合原理，通过电泳分离外泌体蛋白，然后与特异性抗体反应，检测外泌体标志物的表达情况，可用于确定外泌体中是否存在特定的标志物蛋白。
酶联免疫吸附试验（ELISA）：将外泌体捕获在固相载体上，然后与特异性抗体结合，通过酶标二抗检测结合的抗体量，从而定量分析外泌体标志物的含量，具有较高的灵敏度和特异性。
流式细胞术：将外泌体与荧光标记的特异性抗体结合，通过流式细胞仪检测外泌体表面标志物的表达情况，可对单个外泌体进行分析，快速、准确地鉴定外泌体及其亚群。
免疫电镜：将外泌体样品与特异性抗体结合，然后用电子显微镜观察，可直观地看到外泌体表面标志物的分布和定位，同时还能观察外泌体的形态和大小。
㈢ 流式细胞术检测：细胞凋亡、细胞自噬、细胞因子、外泌体
流式细胞术(flow cytometry，FCM) 是一种高级细胞定量分析技术，以其快速、高精度、多参数和高通量的特点，广泛应用于生物学和医学研究中。以下是流式细胞术在细胞凋亡、细胞自噬、细胞因子检测以及外泌体检测中的应用。
在检测细胞凋亡中，流式细胞术主要通过线粒体膜电位检测和Caspase-3活性检测来实现。线粒体膜电位检测原理是利用荧光探针 JC-1 的聚集特性，正常细胞线粒体膜电位较高，JC-1形成聚合物并产生红色荧光，而凋亡细胞线粒体膜电位降低，JC-1为单体，产生绿色荧光。通过检测绿色和红色荧光，可以定量分析线粒体膜电位的变化。Caspase-3活性检测则是基于细胞内蛋白酶的级联活化，通过检测活化状态的Caspase酶使底物发出荧光，以此量化凋亡细胞。
对于细胞因子的检测，Cytometric Bead Array (CBA)技术被广泛应用。CBA技术基于流式细胞检测系统，能同时对单个样品中的多个指标进行多重定量分析，实现样本中细胞因子的精确检测。
在细胞自噬检测中，LC3-II作为自噬的生物学标记，其在自噬发生时位于自噬小体内。通过对比同型对照，分析平均荧光强度，可确定自噬的发生。
外泌体检测则主要关注其特有的四次跨膜蛋白，如CD9、CD63和TSG101，外泌体表达的定性定量分析通过包被了抗体的珠子进行流式检测实现。
最后，流式细胞术在科研和医学研究中的广泛应用，包括对照设置、仪器优化、阳性确定、实验流程、标准化操作指南以及科研工具推荐等。这些内容涵盖了流式细胞术的基本原理、应用技巧以及支持工具，是科研工作者不可或缺的知识库。