A. 如何测试转基因食品
测试转基因食品的方法包括基因分析、蛋白质分析、PCR检测、糖类分析、残留物检测与动物实验。首先,基因分析通过PCR或基因测序技术,检查并对比食品中目标转基因成分的基因序列。接着,蛋白质分析利用质谱技术,检测并对比所表达的蛋白质。PCR检测方法针对已知的转基因标记基因,使用PCR技术寻找目标基因片段的存在。糖类分析检测食品中的糖类含量,转基因食品可能引入新的糖类。残留物检测通过检查食品中的除草剂、杀虫剂等残留物,初步判断是否为转基因食品。最后,动物实验比较转基因食品与非转基因食品对动物的生理影响。这些方法均可用于测试转基因食品,综合使用多种方法可提高检测的准确性。
B. 怎样检测转基因食品
目前对转基因食品的检测按原理主要分为针对外源蛋白质和针对外源DNA两种鉴定技术。
外源蛋白质的测定
即从蛋白质水平对转基因食品进行检测,实际应用中主要采用的是免疫学检测法,即Western杂交、酶联免疫吸附法(ELISA)和试纸条法。免疫学检测法可以检测具有抗原性的蛋白质类表达产物的存在,它是通过抗原抗体特异反应来实现的。
Western杂交 Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法,具有很高的灵敏性,可以从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白。Western杂交检测的关键是抗体的制备。
酶联免疫吸附法 ELISA建立了固-液抗原抗体反应体系,并采用酶标记,抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶的放大作用,使测定的灵敏度极高,可检测出1pg的目标物,同时酶反应还具有很强的特异性。它的检测原理和过程基本与Western杂交检测相似。
试纸条法 此法是在最近15年发展起来的,之前主要用于医学领域。与ELISA相似,这种测定方法是将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上,当纸上抗体和特异抗原结合后,再和带有颜色的特异抗体进行反应,就形成了带有颜色的三明治结构,并且固定在试纸条上,如果没有抗原,则没有颜色。因此整个操作相对简单一些。目前市场上也出现了一些此类测试的试纸盒。
外源蛋白质检测法快速,具有一定的灵敏度,也能进行半定量,尤其是试纸条法,不需要特殊的仪器设备,适用于现场检验或初筛。但外源蛋白质检测法有三方面的局限性:(1)由于抗原抗体反应的专一性,每种转基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法,而转基因产品种类繁多,要建立所有转基因产品的蛋白质检测法工作量很大;(2)对于加工过的转基因食品,其蛋白质很容易被破坏,从而影响检测结果的准确行;(3)有些插入基因还具有表达部位特异性,这些金银的表达并不像DNA那样存在转基因作物的任何部位,甚至有的转基因产品的插入基因根本不表达或表达量很低。这些都会影响检测结果。
外源DNA的检测
目前对于外源基因的检测主要是通过对转入的外源基因进行PCR扩增,然后进行紫外或荧光检测。PCR技术全称“聚合酶链反应技术”,是一种在体外由引物引导的DNA聚合酶催化的聚合反应,能在短时间内准确地将目的序列大量复制。在转基因食品检测方面,主要是用于从DNA即基因水平来鉴定被测食品。由于它的快速、灵敏、费用低、检测仅需微量的DNA并且可以同时检测多个样品,正成为这一领域日趋成熟的方法之一。
定性PCR 转基因食品重组DNA的基本机构包括启动子、目的基因、终止子和标记基因。由于目的基因种类繁多,所以先用转基因食品最常用的转录启动子CaMV35S、转录终止子NOS及抗生素抗体基因NPTII三个序列来设计引物进行PCR反应,对结果阳性者可再检测目的基因。
定量PCR PCR反应具有高度特异性和敏感性,但对实验技术的要求很高,其结果易受许多因素的干扰而产生误差,一般PCR只用作转基因食品的定性筛选检测。针对所存在的问题,研究人员在实验设计中引入内部参照反应,以消除检测时的干扰,并与已知含量的序列GMO标准样的PCR结果进行比较,从而可以半定量地检测待测样品的GMO含量。
近年来定量竞争PCR和实时荧光定量PCR都已用于转基因食品的定量检测。竞争性定量的基本原理是用人工设计的竞争模板以不同稀释度与标本共同扩增,以竞争模板的稀释度和结果做标准曲线,判断标本中待测核酸的量。
实时荧光PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。这种检测方法采用独特全封闭反应,只须在加样时打开一次盖子,减少了污染,具有高度的灵敏性。
PCR-ELISA 这是一种将PCR的高效性与ELISA高特异性结合在一起的检测方法,它利用地高辛或生物素等标记引物,将PCR扩增产物与固相板上特异的探针结合,再加入抗地高辛或生物素的酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最后使底物显色,在酶标仪上读取数值。利用PCR-ELISA法对转基因大豆检测,灵敏度比欧盟推荐的PCR方法高5-10倍。它快速方便,避免了有毒物质EB的使用,适合大批量自动检测。
目前转基因成分的检测方法主要有ELISA(酶联免疫吸附法)和侧向流动免疫测定法、普通聚合酶链式反应(PCR)的优缺点、实时荧光定量PCR(qPCR)、恒温荧光PCR检测方法等。
ELISA(酶联免疫吸附法)
ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性,具有简便、快速、费用低等特点,但易出现本底过高的问题,且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。直接法和双抗夹心法都要制备特异的酶标抗体,制备方法较繁琐,且一种酶标抗体只能检测一种蛋白,而适用于间接法的酶标抗抗体已有商品出售。一种转基因蛋白的检测试剂盒是否能在表达相同外源蛋白的不同植物之间通用还要进行试验。
侧向流动免疫测定法:
“侧流”型免疫测定是最近15年发展起来的,该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似,这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理,但该方法是在一种固相支持物上而不是在管子里进行,标记的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面上的抗体。目前市场上已出现了用于侧向流动免疫测定并能用于野外测试的试剂盒。与DNA为基础的检测方法相比,该方法的样品处理简单。由于目标蛋白一般是水溶的且抗体具有高度专一性,因此检测样品仅需要初步处理便能达到测试的要求,具有快速、简便、适合野外操作等优点。侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法,将试纸条放在待测样品抽提物中,5~10分钟就可得出结果,不需要特殊仪器和熟练技能。但一种试纸条只能检测一种蛋白质,且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。侧向流动免疫测定方法是定性或是半定量。按照合适的采样步骤,可以在给定的一批样品中以99%的置信水平检测出少于0.15%的转基因成分。
普通聚合酶链式反应(PCR)的优缺点
优点:
1)准确度较高
2)灵敏度高
3)价格低
缺点:
1)操作复杂需要一定的专业背景
2)电泳时使用的染料对人体有一定危害
3)只能检测一个指标
实时荧光定量PCR(qPCR)的优缺点
优点
1)灵敏度高
2)准确度高
3)高通量
4)可以实现实时监控
5)可以实现定量判断
缺点
1)价格高昂
2)操作复杂
3)配套产品少
4)维护费用高
恒温荧光PCR检测方法:
恒温PCR技术的特点可以概括为比PCR更准确、快速、易于实现。因实现恒温扩增,特殊的引物设计,使得检测更准确;无变性、退火等环节,全过程均在进行DNA片段的复制,没有时间损耗,使检测更快速;无热循环需求,设备简单,更易于推广应用。为PCR技术推广应用创造了全新的空间。目前主流的实时恒温荧光PCR仪有广州迪澳生物Deou—308C恒温荧光检测仪、3M Molecular Detection System、Optigene Genie II 和 Genie III、Qiagen TuberScaner II、Envirologix DNAble等。