⑴ 谁知道测DNA甲基化的方法
http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多图片粘贴不过来，还不如你自己看。
一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在肿瘤发生时，肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% , 同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的广泛研究。
近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
从原理上来看，Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测，以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据，通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本，并用混合的PCR产物
作为校正。其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变。因而，用它处理样本后，再进行PCR扩增，甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理，它的基因频率为0－100％。在此，我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点。这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和精确性。实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的，而在肿瘤样本中高甲基化。通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段，并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）。使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物，其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替，以减少计算的数量。再通过人工检测测序引物可能存在的错配。此外，同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照，扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景。
PCR引物设计完全与模板相匹配，不覆盖任何甲基化多态性区域。使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物，10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段，扩增片段长度为144bp。反应体系为60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，终体积为50μL。PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟，然后在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环，最后一步延伸步骤在72℃下4分钟，中止反应。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳动物基因组中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一种基因外修饰，不改变DNA的一级结构; 他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用. 全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象. DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
⑵ 如何进行DNA甲基化分析
基因甲基化的检测方法主要有以下几种：
甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、甲基化敏感扩增多态性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP是利用对DNA甲基化敏感的两种同裂酶Hpa II和Msp I来对基因组DNA进行酶切和连接。由于两种酶能够识别相同的限制性酶切位点，即CCGG位点。当DNA序列中的CCGG位点出现不同程度的甲基化状态时，会分别被这两种酶识别，以有无产物的方式体现出来。
4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。