药物微生物检测方法药典

Ⅰ 2010年版药典中微生物检验有哪些更新

2005版药典与2010版的区别（共32处）
1. 2010版药典增加对人员的要求
2. 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
3. 2010版药典规定了防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出
4. 2010版药典规定了日常检验还需要对环境进行监控
5. 对于选择性培养基，药典2010版去掉了中和剂的规定性推荐。其用量同验证试验。
6. 培养基 药典2010版删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧菌的规定
7. 删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定
8. 对于菌液制备中 药典2010版增加了“菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若在2~8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证的贮存期内使用。”
9. 药典2010版修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法，规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液稀释
10. 在稀释液、冲洗液及其制备方法中，药典2010版增加了“3.根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液，冲洗液”
11. 在方法验证中，2010版药典将“该药品”改为“该产品”。 应为医疗器具扩大适用范围。
12. 在方法验证中的菌种及菌液制备，2010版药典将大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）4 ]的菌液制备。
13. 在方法验证中的薄膜过滤法中，2010版药典，增加了“取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤”即明确了2005版药典的“将规定量的供试品按…..”。
14. 去掉了“或使用中和剂如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸”
15. 在检验量中，2010版药典去掉了“采用直接接种法时”
16. 在阳性对照中，2010版药典去掉了“（大肠埃希氏菌的菌液制备…..的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌）”将2005版的“阳性对照菌的菌悬液制备同培养基灵敏度检查”改成了“阳性对照菌的菌悬液制备同方法验证试验，”。
17. 在阴性对照中，2010版药典去掉了“且对微生物生长及存活无影响”,改成了“对微生物无毒性”
18. 在水溶液供试品中，2010版药典增加了“所用的冲洗量，冲洗方法同方法验证试验。”
19. 薄膜过滤法中：2010版药典增订了抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜的规定
20. 薄膜过滤法中：2010版药典对每片滤膜的总冲洗量进行了规定，不得超过1000ml
21. 薄膜过滤法中：2010版药典修订了无菌气（喷）雾剂供试品的检验方法，规定冰室的温度应至少为-20℃
22. 对装有药物的注射器供试品的检验方法进行了详细的规定
23. 在直接接种法中，2010版药典删除了“每只（或瓶）”
24. 在直接接种法中，2010版药典删除了“每种培养基接种的管数同供试品的检验数量”
25. 在直接接种法中，2010版药典删除了“β-内酰胺类或磺胺类供试品：取规定量，混合，加入适量的无菌β-内酰胺酶溶液或对氨基苯甲酸溶液使中和，接种至各管培养基中。或直接接入含β-内酰胺酶或对氨基苯甲酸的各管培养基中。”改为“有抑菌活性的供试品 取规定量，混合，加入适量的无菌中和剂或灭火剂，然后接种至各管培养基中。或直接接入环适量中和剂或灭活剂的各管培养基中。”
26. 对于培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长的情况，删除了可划线接种于斜面培养基上的规定，同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判断的规定
27. 在结果判断中，2010版药典，强调性增加了：“阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。”。删除了“（3）因性对照管有菌生长”
28. 表1 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍
29. 表2 修订了表格名称，明确了该表格用于确定液体制剂的最少检验量
30. 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确 规定最少检验数量应加倍
31. 表3 修订了表格名称，明确了该表格用于确定固体制剂的最少检验量
32. 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确 规定最少检验数量应加倍

Ⅱ 中国药典微生物限度检查法的微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过100cfu。
大肠埃希菌每1g或lml不得检出. 3.1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.2耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂
细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²，不得过10cfu。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。
大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml或l0cm²，不得检出。
3.3阴道、尿道给药制剂
细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。
霉菌数和酵母菌数每1g、lml或l0cm²应小于10cfu。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得检出。
3 .4直肠给药制剂
细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每1g或lml不得过100cfu。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg或lml不得检出。
3.5其他局部给药制剂
细菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。 参照相应制剂的微生物限度标准执行。
注1：本检查法中白色念珠菌检查所描述该菌在念珠菌显色培养基上的菌落特征，是指该菌在法国科玛嘉公司提供的科玛嘉念珠菌显色培养基上生长的菌落特征。给出这一信息是为了方便本方法的使用者，并不表示对该公司产品的认可．若其他等效产品具有相同的效果，那么也可使用其他等效的产品。
以上文中方法中提到的“无菌检查法（附录XII A）”为《中国药典》2010版二部附录XII A无菌检查法。

Ⅲ 药典规定口服药物不需要的微生物检查项目是

《中国典》2015年版微生物限度检查法修订后将分为三个附录：

1、非无菌品微生物限度检查：微生物计数法

2、非无菌品微生物限度检查：控制菌检查法

3、非无菌品微生物限度标准。

修订后的微生物限度检查法暂不收载于《中国典》2010年版第二增补本而将直接收载《中国典》2015年版，在正式实施前的公示期内将进一步完善以保证方法的适应性和可操作性。

非无菌品微生物限度标准的整合、修订

1、典委员会微生物专业委员会的修订思路

2、修订后限度标准的总体结构

3、修订后限度标准各项具体规定

典委员会微生物专业委员会的修订思路

修订思路

(1) 2010版中国典一、二、三部微生物限度本中项目的对比、整合

整合：采用一部的项目作为合并后限度标准的基础

(2)与美、欧、日典比较，修订中国典的微生物限度标准

1、参照欧、美、日典一致的表示形式，采用较清晰直观的表格形式列出各类品和原敷料的微生物限度标准

2、菌数计数结果以10n表示；

3、以“需氧菌总数”取代“细菌数”，以“耐胆盐革兰阴性菌”取代“大肠菌群”

2、修订后限度标准的总体结构（共9项、4个表）

1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法的规定

2、用于、烧伤或严重创伤的局部给制剂应符合无菌检查法的规定

3、非无菌化学品及生物制品制剂的微生物限度标准

4、非无菌不含材原粉的中制剂微生物限度标准

5、非无菌含材原粉的中制剂微生物限度标准

6、非无菌的用原料及辅料微生物限度标准

7、中提取物及中饮片的微生物限度标准

8、有兼用途径的制剂应符合各给途径的标准

9、霉变、长螨者以不合格论

2015版微生物限度标准的特点及展望

特点：

1、很好地分析、汇总了现一、二、三部的限度标准的项目

能考虑和前向性地制订符合我国传统中特点的微生物限度标准

2、化学、生物制品的限度标准（菌数及控制菌）已与美、欧、日典的限度标准一致或更严格

3、新设立的中提取物和中饮片的微生物限度标准（仅规定了控制菌），菌数计数限度等待调研数据

展望：

1、结合GMP管理的步伐，进一步合理制定含材原粉的中制剂的微生物限度标准

2、在开展课题积累数据、区分用法的基数上完善中提取物、中饮片、草的微生物限度标准

Ⅳ 2015版药典微生物限度结果判断的标准怎么理解

2015版《中国药典》即将公布，新修订的《中国药典》对药品微生物检验和检定方法发生了重大变化。着重解决药品微生物相关检查方法及微生物限度标准与欧美等药典的协调统一问题。

2015版《中国药典》即将公布，新修订的《中国药典》对药品微生物检验和检定方法发生了重大变化，本次修订是对《中国药典》多年来固有的微生物检查系统进行根本性的调整，着重解决药品微生物相关检查方法及微生物限度标准与欧美等药典的协调统一问题。
宏观变化一：全面与国际接轨
以无菌检查法为例

Ⅳ 中国药典中药物微生物检测在哪部

你好，微生物检测方法在中国药典2010年版二部附录XI J，具体方法为附录XI J微生物限度检查法
微生物限度检査法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅
料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、
酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁
净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格
遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品
中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期
按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方
法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活
剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检査法中细菌及控制菌培养温度为
30〜35°C;霉菌、酵母菌培养温度为23〜28°C
检验结果以lg,lml、10g、10ml或10cm
2为单位报告，特
殊品种可以最小包装单位报告。
检验量
检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm
2
)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂
为100cm
2
»贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要
求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中
10g或10ml用于阳性对照试验）。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂
还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单
位）的3倍量供试品。
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法
制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不
应超过451C。供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过
1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1. 液体供试品
取供试品10ml ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至
100ml，混匀，作为1 ： 10的供试液。油剂可加人适量的无菌
聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混
合的供试品原液作为供试液。
2. 固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g ，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至
100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1 ： 10的供试
液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温
使供试品分散均匀。
3. 需用特殊方法制备供试液的供试品
(1) 非水溶性供试品
方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的（温度不超
过45'C)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无
菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加人45"的
pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供
试品充分乳化，作为1 ： 20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙
酯（制法见附录H H无菌检査法中供试品的无菌检查项下）
和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯
的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加人45\：的pH7.0
无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5〜：L0分钟，萃取，静
置使油水明显分层，取其水层作为1 •• 10的供试液。
(2) 膜剂供试品.
取供试品100cm
2
，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓
冲液lOOmK必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1 ： 10的
供试液(3) 肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g,加pH6. 8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制
剂）或pH7. 6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，
置45t:水浴中，振摇，使溶解，作为1 :
10的供试液。
(4) 气雾剂、喷II剂供试品
取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消
毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室
温，并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器
吸出全部药液，加至适量的PH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
(若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80)中，混匀，取
相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1 ： 10的供试液。
(5) 贴剂供试品
取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或
塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱
布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置
于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的
稀释剂中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。贴剂也可采
用其他适宜的方法制备成供试液。
(6) 具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除
供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。
① 培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养
基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测
定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml,每
lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基,混匀，凝固，
培养，计数。每lml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即
为lml的菌落数，计算每lml供试液的平均菌落数，按平皿法
计数规则报告菌数;控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
② 离心沉淀法取一定量的供试液，500转/分钟离心3
分钟，取全部上清液混合。用于细菌检査。
③ 薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的"薄
膜过滤法"。
④ 中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试
品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或
灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

Ⅵ 中国药典微生物限度检查法的控制菌检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。菌种
对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC ( B ) 44l02]
金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratypHi B )〔CMCC ( B ) 50094〕
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC ( B ) 10104〕
生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为10～100cfu的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用．若保存在2～8 ℃可在24小时内使用。
适用性检查
控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各培养基的检测项目及所用菌株见表2。
表2 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查 控制菌检查 培养基 特性 试验菌株 大肠埃希菌 胆盐乳糖培养基 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群 乳糖胆盐发酵培养基 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 乳糖发酵培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 沙门菌 营养肉汤培养基 促生长能力 乙型副伤寒沙门菌 四硫磺酸钠亮绿培养基 促生长能力 乙型副伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺菌属琼脂培养基 促生长能力+指示能力 乙型副伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 促生长能力+指示能力 乙型副伤寒沙门菌 三糖铁琼脂培养基 指示能力 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基 促生长能力 铜绿假单胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 促生长能力 铜绿假单胞菌 抑制能力 大肠埃希菌 绿脓菌素测定用培养基 促生长能力+指示能力 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 亚碲酸盐肉汤培养基 促生长能力 金黄色葡萄球菌 抑制能力 大肠埃希菌 卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基 促生长能力 金黄色葡萄球菌 抑制能力 大肠埃希菌 梭菌 梭菌增菌培养基 促生长能力 生孢梭菌 哥伦比亚琼脂培养基 促生长能力 生孢梭菌 白色念珠菌 沙氏葡萄糖液体培养基 促生长能力 白色念珠菌 沙氏葡萄糖琼脂培养基 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 念珠菌显色培养基 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 抑制能力 大肠埃希菌 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 液体培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌（表2） 于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养墓促生长能力检查
取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
培养基抑制能力检查
接种不少于100cfu的试验菌（表2）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。
固体培养基指示能力检查
取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu )（表2）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
液体培养基指示能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌（表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。 当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。
验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
菌种及菌液制备
同控制菌检查用培养基的适用性检查。
验证方法
取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时．取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养荃或取出滤膜接人增菌培养基中。
结果判断
若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。
阳性对照试验
阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加菌量为10～10Ocfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。
阴性对照试验
取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长，
（1）大肠埃希菌（Escherichia coli）取供试液10ml（相当于供试品lg、lml、10cm²)，直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。
取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加人数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。
表3 大肠埃希菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 曙红亚甲蓝琼脂 紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽 麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润 （2）大肠菌群（Coliform）取含适量（不少于10ml )的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1 :10的供试液lml（含供试品0.1g或0.1ml）、1: 100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1:1000的供试液1 ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加人稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。
乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养墓的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表4所列的菌落形态特征不符或为非革兰氏阴性无芽抱杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰氏阴性无芽抱杆菌，应进行确证试验。表4 大肠菌群菌落形态特征 培养基 菌落形态 曙红亚甲蓝琼脂 紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐．表面光滑，湿润 麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润 确证试验从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。若产酸产气，判该乳糖胆盐发醉管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。
根据大肠菌群的检出管数，按表5报告lg或lml供试品中的大肠菌群数。
表5 可能的大肠菌群数 各供试品量的检出结果 可能的大肠菌群数N（个/g或ml ) 0.1g或0.1ml 0.01g或0.01ml 0.01g或0.01ml + + + > 10³ + + 10²< N < 10³ + ― ― 10 < N < 10² ― ― ― < 10 注：+代表检出大肠菌群；―代表未检出大肠菌群．
（3）沙门菌（salmonella）取供试品10g或10ml ,直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。
取上述培养物1ml，接种于10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6所列的特征，判供试品未检出沙门菌。
若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验，确认是否为沙门菌。
表6 沙门菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色 沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色 曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色．透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落 麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色 （4）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）取供试液10ml（相当于供试品1g、lml、10cm²)，直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验。
氧化酶试验
取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
若斜面培养物为非革兰氏阴性无芽抱杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。
绿脓菌素（Pyocyanin）试验
取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3～5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加人lmol / L盐酸试液约lml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。
若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品枪出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。
( 5 )金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）取供试液l0ml（相当于供试品1g、lml、l0cm²)，直接或处理后接种至适见（不少于100ml）的亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表7所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
表7 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 甘露醇氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7～lmm 卵黄氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm 若平板上生长的菌落与表7所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰氏染色．并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24小时，做血浆凝固酶试验。
血浆凝固酶试验
取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（1 : 1 ) 0.5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml ,即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。
若上述疑似菌为非革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
( 6 )梭菌（Clostridium）取供试液10ml（相当于供试品1g、lml、10cm²) 2份，其中l份置80 ℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48～72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。
过氧化氢酶试验
取七述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。
若上述可疑菌落为革兰氏阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶试验阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。
( 7 )白色念珠菌（Candida albicans）取供试液10ml（相当于供试品1g、lml、l0cm²）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养48～72小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上 ，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。
若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色．挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上．培养24～48小时。取培养物进行染色、镜检及芽管试验。
芽管试验
挑取l%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，于35～37 ℃培养1～3小时，置显微镜下观察孢子上有否长出短小芽管。
若上述疑似菌为非革兰氏阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。 供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。
若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定．判供试品不符合规定。

Ⅶ 抗生素微生物检定方法在药典哪部里

抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点
录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博

抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：
1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层

为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺
9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。 操作要点
第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。
溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。
标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。 试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。
一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。
试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。
加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。
在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。
加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃。 放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。
抗生素原料药：不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或?g/mg）表示。检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定。

粉针剂：指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或?g/mg）或整瓶效价。
取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。
水针剂（注射液）：即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。
效价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。
素片、薄膜衣片：称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。再量取适量稀释至规定浓度。
注意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意。为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。 糖衣片、肠溶片：取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。
胶囊剂：取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。
颗粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。量取适量稀释制成供试品溶液。测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平

均每袋（包）的效价，根据标示量即可算出含量。
软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗，带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，依法操作，计算效价。 实验要点
磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇 主要问题：抑菌圈偏小 解决：
1. pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）
2. 滴加药液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。
3. 培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量。
啤酒酵母菌的培养 主要问题：生长不良
CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面
解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时
沙氏培养基 蛋白胨10g 葡萄糖40g 琼脂13g 水1000ml 调节灭菌后pH5.4～5.8

YPD培养基 蛋白胨10g 葡萄糖40g 酵母粉5g 琼脂13g 水1000ml
管碟法特点：
优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。
缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度
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Ⅷ 微生物限度检查在中国药典2015版附录多少

《中国药典》2015年版微生物限度检查法修订后将分为三个附录：

1、非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法

2、非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查法

3、非无菌药品微生物限度标准。

修订后的微生物限度检查法暂不收载于《中国药典》2010年版第二增补本而将直接收载《中国药典》2015年版，在正式实施前的公示期内将进一步完善以保证方法的适应性和可操作性。

非无菌药品微生物限度标准的整合、修订

1、药典委员会微生物专业委员会的修订思路

2、修订后限度标准的总体结构

3、修订后限度标准各项具体规定

药典委员会微生物专业委员会的修订思路

修订思路

(1) 2010版中国药典一、二、三部微生物限度本中项目的对比、整合

整合：采用一部的项目作为合并后限度标准的基础

(2)与美、欧、日药典比较，修订中国药典的微生物限度标准

1、参照欧、美、日药典一致的表示形式，采用较清晰直观的表格形式列出各类药品和原敷料的微生物限度标准

2、菌数计数结果以10n表示；

3、以“需氧菌总数”取代“细菌数”，以“耐胆盐革兰阴性菌”取代“大肠菌群”

2、修订后限度标准的总体结构（共9项、4个表）

1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法的规定

2、用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法的规定

3、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准

4、非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准

5、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准

6、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准

7、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准

8、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准

9、霉变、长螨者以不合格论

2015版微生物限度标准的特点及展望

特点：

1、很好地分析、汇总了现一、二、三部的限度标准的项目

能考虑和前向性地制订符合我国传统中药特点的微生物限度标准

2、化学药、生物制品的限度标准（菌数及控制菌）已与美、欧、日药典的限度标准一致或更严格

3、新设立的中药提取物和中药饮片的微生物限度标准（仅规定了控制菌），菌数计数限度等待调研数据

展望：

1、结合GMP管理的步伐，进一步合理制定含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准

2、在开展课题积累数据、区分用法的基数上完善中药提取物、中药饮片、草药的微生物限度标准

Ⅸ 2015版药典和2010版药典对微生物限度检查的区别

2015版药典对培养基系统、实验方法、实验环境规定等方面做出了重大修订，方法应用范围增加了生物方法；
还有一些细节的变化，例如阳性对照试验，10版药典采用金黄色葡萄杆菌，而2015版采用不同菌种；
总之2015版药典是采用了先整合后优化、求大同存小异等整合原则。
我了解有限，以上仅供参考。

Ⅹ 中国药典微生物限度检查法的介绍

中国药典微生物限度检查法，为《中国药典》附录收载的关于药品微生物检查的法定方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。