‘壹’ 核酸分子杂交探针
核酸分子杂交探针是现代分子生物学实验中的一项关键技术。它涉及了将特定标记物，如放射性同位素32P或荧光物质异硫氰酸荧光素等，连接到特异性核酸序列片段上。其目的是识别和检测靶DNA中的特定核苷酸序列。制备带有标记物的探针，可使与靶序列互补形成的杂交双链携带特定的信号。通过适当方法接受来自杂交链的信号，即可对靶序列DNA的存在及其分子大小进行准确鉴别。在分子生物学领域，核酸分子杂交与探针的制备和使用紧密相关，共同构成了研究核酸结构与功能的基础技术。这一技术的应用范围广泛，涵盖了基因序列分析、基因定位、基因表达检测等多个方面。
在现代分子生物学实验中，核酸分子杂交探针技术被广泛应用于多个研究领域。通过精确设计和制备带有标记的探针，科学家能够对目标DNA序列进行特异性识别和定量分析。这一技术不仅能够检测靶序列是否存在，还能提供关于序列长度和结构的详细信息。例如，在基因定位研究中，通过将探针与特定基因区域杂交，可以确定基因在染色体上的位置。此外，核酸分子杂交探针技术在基因表达分析中也发挥着重要作用，通过检测特定mRNA序列的存在和量，可以揭示基因在不同组织或细胞状态下的表达模式。
核酸分子杂交探针技术在基因组学领域中同样展现出强大的应用潜力。通过设计与不同基因座或特定遗传标记互补的探针，科学家能够进行大规模的基因组扫描，探索遗传变异与疾病之间的关联。这一技术在遗传病研究、基因编辑技术评估以及人类遗传学研究中扮演着重要角色。通过精确检测和量化特定基因或基因片段的存在，核酸分子杂交探针技术为遗传学研究提供了强有力的工具。
总之，核酸分子杂交探针技术是现代分子生物学实验中的核心手段之一。它不仅使科学家能够对靶DNA序列进行特异性识别和定量分析，还为基因组学、遗传学等领域的深入研究提供了强大的技术支持。通过精确设计和制备带有标记的探针，结合核酸分子杂交技术，科学家能够揭示基因序列的结构、表达模式及其与疾病之间的关联，为遗传病的诊断、治疗以及遗传资源的利用提供了重要依据。这一技术的应用范围广泛，对于推动生命科学领域的发展具有重要意义。
‘贰’ 细胞生物学中简答细胞凋亡的检测技术有哪些
一、形态学观察方法
1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳
（一）检测原理
细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
（二）结果判断
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
（一）检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
2、在微定量板上吸附组蛋白体；
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；
5、加酶的底物，测光吸收制。
（二）用途
该法敏感性高，可检测5*100/ml凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
四、流式细胞仪分析
（一）检测原理
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
（二）应用价值
流式细胞仪检测具有以下特点：
1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
2）、可以做许多相关性分析
3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。
■DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3.的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种：
1、原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3－OH端
2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3－OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。
3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是最为理想的检测细胞凋亡的方法。