胆汁酸常用检测方法

1. 胆汁酸的胆汁酸测定对于下列疾病具有重要临床意义

1．肝胆疾病
2．胃肠疾病
3．引起胆汁酸代谢发生改变的其它疾病
在研究各种疾病对胆汁酸代谢的干扰作用时，经常对生物标本进行严格的分级分离，并运用层析技术对各个胆汁酸组分进行详尽的研究。但是，在临床实践中，大多数情况下，如对肝病的筛选，只需对总胆汁酸水平进行简单的酶学测定。本章将集中计论血清总胆汁酸对肝系统疾病的影响，并对临床观察到的大便、胆汁、肠道抽取物等标本中的总胆汁酸病理水平进行简单的讨论。
一、肝胆疾病中的血清胆汁酸
1．急性肝炎
发生急性肝炎时，血清胆汁酸浓度急剧升高。通常情况下，发病初期迅速升高并达到峰值的胆汁酸几科与ASAT同时恢复于正常水平。但与其他临床检验指标相比，胆汁酸水平恢复至正常进程比较缓慢，呈渐进状态。
几项研究已经证实，血清总胆汁酸对于跟踪检测病毒肝炎病情汁有价值。在急性病毒性肝炎康复期，餐后血清总胆汁酸水平是一个最灵敏的检测指标。如果餐后血清总胆汁酸浓度持续升高，说明病毒性肝炎正在向慢性肝炎转化。对处于急性肝炎康复期的患者，血清胆汁酸水平长期升高，则表明患者有可能发生了严重的肝损伤，需要对患者进行仔细的跟踪监视，并可能需要做肝脏活检。
2．慢性肝炎
由于常规肝脏检查对慢性肝炎论断的相对不敏感性，要评价慢性肝脏疾病(慢性持续肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化)严重程度，就必须进行组织学检测分析。但是，近几十年来的临床研究结果表明，血清胆汁本能水平可作为检测慢性肝炎中肝损伤的一个敏感指标。研究证实血清总胆汁酸浓度数值可以用来区分活动性与非活动性肝炎。血清胆汁酸测定还有助于对慢性肝炎的治疗监控，并可以替代需要反复肝脏活检实验。
3．肝硬化
肝硬化患者由于胆汁酸贮存量减少，血清胆汁酸浓度升高，尿中硫酸化胆汁酸的排出量出随之升高。严重肝硬化患者，由于功能性肝细胞数量减少，使胆汁酸合成能力受到抑制。但是，中等程度肝硬化患者胆汁酸贮存量的减少，则可能是由于胆汁酸合成调控发生缺陷引起的。肝硬化时，尽管胆汁酸合成总量有所下降，但是血清胆汁酸水平仍然升高，这可能与肝细胞受损、肝实质细胞数量减少以及门静脉系统分流等因素有关。
肝硬化各个不同时期血清胆汁酸浓度均有所升高，但以肝硬化后期最为明显。
有些肝硬化病人，尽管胆红素、转氨酸、碱性磷酸酶水平保持正常，但血清胆汁酸水平明显升高。
当肝硬化活动性减至最低，且其他常规肝功能恢复正常时，血清胆汁酸浓度常常仍然保持升高状态，因而可将血清胆汁酸水平用于低活性期肝硬化患者的临床检测。
4．酒精性肝脏疾病
通常情况下，酒精性肝脏疾病患者的血清胆汁酸浓度明显升高。与形态学损伤较轻的中度酒精性肝脏疾病患者相比，发生严重肝脏损伤的患者，如酒精性肝炎患者、血清胆汁酸浓度升高更为明显。
最新的研究结果表明，与其他常规肝功能检测方法如酶检测、并乳糖减少试验、BSP检测法相比，血清胆糖酸测定所得到的关于酒精性肝脏疾病患者肝损伤程度方面的信息更为灵敏和可靠。血清胆汁酸与β-已糖胺酶组合测定，现以被建议作为有价值的评价酒精性肝疾病的检测方法。
5．胆汁郁积
已经发现，血清胆汁酸的定量测定可作为检测胆汁郁积的一种灵敏、特异的方法。在发生肝外胆汁阻塞时，血清胆汁酸浓度显着升高。大多数肝内胆汁郁积患者，如急性肝炎、初级胆汁肝硬化、婴儿胆汁郁积、妊娠性胆汁郁积、肝癌、良性复发性肝内胆汁郁积患者，血清胆汁酸浓度均明显升高。
发生胆汁阻塞时，胆汁分泌下降，并迅速改变胆汁酸贮存量的分布，使得血清和尿液中的胆汁酸浓度显着升高。
现已发现，大多数胆汁郁积患者血清中的碱性磷酸酶、5i-核苷酸酶和γ-谷氨酰转移酶的活性也明显升高。胆汁阻塞时上述酶活性升高的机理目前尚不清楚。最可能的机理是:胆汁郁积发生时，肝脏中的这类膜结合酶产生诱导作用，随后在胆汁酸的作用下滤过微管膜。
血清胆汁酸水平在发生胆汁阻塞后迅速达到峰值，并在此后长期的阻塞过程中基本保持不变。与此相反，胆红素水平则在胆汁阻塞过程中缓慢升高。血清碱性磷酸酶活性升高则呈不规则性，个体间差异性较大。
通过引流法解除肝外胆汁酸阻塞后，血清胆汁酸水平迅速降低。而血清胆红素、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶等的活性则在外部引流过程中慢慢恢复至正常。
但是，血清总胆汁酸测定似乎在监别诊断肝内胆汁郁积和肝外胆汁郁积方面作用不大。
6．初期胆汁肝硬化
初期胆汁肝硬化是一种胆汁郁积性疾病，这时的肝实质损伤可能是最小的，常规肝功能检测仅能发现轻微的改变。对于大多数初期胆汁酸肝硬化患者来说，血清胆汁酸水平明显升高，因此可将其用作评价此症的一项有价值的诊断指标。初期胆汁酸肝硬化早期阶段，尽管空腹血清胆汁酸可能仍保持在正常范围内，但餐后胆汁酸水平却异常升高，说明胆汁肝硬化确已发生。
7．妊娠性胆汁郁积
无并发症妊娠时，血清总胆汁酸水平始终维持在正常范围内，尽管随着孕期的推移，经常会发生CDCA水平升高的现象。
但发生妊娠性胆汁郁积时，血清胆汁酸水平明显升高。因此，胆汁酸的测定有助于鉴别诊断胆汁郁积性瘙痒和非胆汁郁积性瘙痒。
其他一些检测指标，如γ-GT、胆经素、碱性磷酸酶等，在正常妊娠过程中经常呈波动状态，因此在这些情况下，血清胆汁酸具有重要的诊断价值。
8．儿科肝脏疾病
由于未成熟胆汁酸的代谢，新生儿血清胆汁酸水平明显高于成人。发生新生儿肝炎及各种儿科胆汁郁积症时，患者空腹胆汁酸水平均急剧升高。但是，测定血清总胆汁酸似科并不足以鉴别诊断各种新生儿肝胆疾病。各个胆汁酸组分的测定，则不仅可为新生儿肝炎及其它各种不同类型的儿科胆汁郁积症提供病因学指征，而且政治家 助于对此类病症病情进展、病理活性、治疗反应跟踪监测。
9．中毒性肝脏疾病
现已证实，经常接触肝细胞毒性物质可造成急性或慢性肝损伤。某些工业用有机溶剂，如四氯化碳、四氯乙烷等对肝细胞均有严重的损害作用。
由于环境中潜在的肝细胞毒性物质种类正在不断增加，因此，临床检验界迫切需要灵敏的筛选方法，对职业性和非职业性脏脏疾病进行早期检测。
大多数常规肝功能检测指标，如转氨酶、γ-谷氨酰转移酶等，对中毒性肝脏疾病早期诊断极不敏感。但是，血清胆汁酸的测定对于肝细胞毒性物质引起的轻度肝脏疾病的检测筛选颇有价值。
最近的一项研究表明，在受检的23名职业性接触聚笨乙烯的工人中，11名工人的血清胆汁酸水平明显升高，仅3名工人的肝脏酶指标升高比较明显。对接触氯乙烯的职业工人的检测结果出表明，空腹血清胆汁酸水平可作为早期肝损伤的一项敏感的检测指标。
血清胆汁酸的测定，对于检测肝细胞毒性药物急性中毒患者的肝损伤，以及跟踪检测此类患者的肝功能均具有重要价值。在检测肝细胞毒性药物的治疗剂量效应方面，血清总胆汁酸水平也是一项重要的检测指标。

2. 常用生化检测项目分析方法举例及参数设置

常用生化检测项目分析方法举例及参数设置

常用生化检测项目有哪些你知道吗?你对常用生化检测项目了解吗?下面是我为大家带来的关于常用生化检测项目分析方法举例及参数设置的知识，欢迎阅读。

一、常用生化检测项目

1.终点法检测常用的有总胆红素(氧化法或重氮法)、结合胆红素(氧化法或重氮法)、血清总蛋白(双缩脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、总胆汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、总胆固醇(胆固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法)、钙(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、镁(二甲苯胺蓝法)等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。

2.固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。

3.连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

4.透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

二、分析参数设置

分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数(analysisparamete)大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用;目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍

(一)必选分析参数

这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。

1.试验名称 试验名称(test code)是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。

2.方法类型(也称反应模式) 方法类型(assay)有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。

3.反应温度 一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。

4.主波长 主波长(primary wavelength)是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。

5.次波长 次波长(secondary wavelength)是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。

6.反应方向 反应方向(response direction)有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。

7.样品量 样品量(sampling volum)一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。

8. 第一试剂量 第一试剂量(first regengt volum)一般是20～300μl，以1μl步进。

9. 第二试剂量 第二试剂量(second regengt volum)一般也是20～300μl，以1μl步进。

10.总反应容量 总反应容量(total reacting volum)在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。

11.孵育时间 孵育时间(incubate time)在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。

12.延迟时间 延迟时间(delay time)在连续监测法中样品与反应试剂(第二试剂)混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。

13.连续监测时间 连续监测时间(continuous monitoring time)在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点(3个吸光度变化值)。

14.校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液(calibrator);线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液;对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。

15.校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值(calibrate coefficient)或由计算得出的K值为理论K值。

16.线性范围 即方法的线性范围(linearity range)，超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。

17.小数点位数 检测结果的小数点位数(decimal point digit)。

(二)备选分析参数

这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。

1.样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。

2.底物耗尽值 底物耗尽值(substrate exhaust limit)在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。

3.前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别(ΔA)设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。

4.试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。

5.试剂空白速率 连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。

6.方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。

7.参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。

(三)某些参数的特殊意义

1.最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围(与线性范围不同)的上限得以扩大。

2.最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例(R/S)为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。

3.弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率(flexrate)功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。

4.试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式

(一)概念

采用一个波长检测物质的光吸收强度的`方式称为单波长(mono-wavelength)方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。

(二)双波长的作用

双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。

(三)次波长的确定方法

当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。

(四)双波长的具体应用

对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白(双缩脲法)主波长500nm，次波长576nm;血清白蛋白(溴甲酚氯法)主、次波长分别为600和700nm;钙(偶氮砷Ⅲ法)主、次波长分别为 660、770nm;磷(紫外比色法)主、次波长为340、405nm，镁(二甲苯胺蓝法)主、次波长为505和 600nm。

三、单试剂和双试剂方式

反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短;②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰;③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶(乳酸脱氢酶)起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD+能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测

各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。

1.试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色;碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄;有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。

试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。

2.试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD(P)H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降;在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。

3.样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。

4.结果可靠性监测

(1)终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。

(2)线性期监测：连续监测法选择时间-吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性;②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。

5.底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-9

6.方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。

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3. TBA是什么意思

硫代巴比妥酸(TBA)法：TBA法的原理是脂质过氧化的降解产物之一一丙二醛(MDA)，可以与硫代巴比妥酸成色。是肝细胞以胆固醇为原料直接合成的胆汁酸，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及相应结合型胆汁酸。

TBA法是一非常简便的方法，一般实验室均可进行。此法与荧光法、化学发光法等有较好的相关性，但不足之处是灵敏度较差，某些因素应加以控制，如线粒体污染，样品中的铁离子等。

(3)胆汁酸常用检测方法扩展阅读：

硫代巴比妥酸(TBA)法在520nm处进行比色测定，可检测丙二醛相对含量的变化，以了解生物膜质过氧化的情况。 TBA法是一非常简便的方法，一般实验室均可进行。

此法与荧光法、化学发光法等有较好的相关性，但不足之处是灵敏度较差，某些因素应加以控制，如线粒体污染，样品中的铁离子等。