检测病毒活性的最佳方法

1. 植物病毒检测的血清学技术都有哪些

植物病毒的外壳是一种核蛋白，在蛋白的表面带有抗原决定簇，当植物病毒进入动物体内时，即可产生与抗原相应的抗体，这种带有抗体的血清即为抗血清。相应的抗原抗体之间可产生专化性的结合，即抗体只能与其相应的抗原结合并产生一定的反应，此即血清反应。这种反应在植物体外也能进行，根据这种反应可以测定两种病毒间的关系。因而，血清学检测成为植物病毒的重要鉴定技术。常见的血清反应主要有以下几种：

中和反应：使含有植物病毒的汁液与相应抗血清中的抗体充分结合，当抗体过量时，可将所有植物病毒抗原全部吸收掉，此时因植物病毒汁液中已没有病毒粒子存在而失去侵染性。此即为中和反应，不仅可对植物病毒进行定性，还可用于定量测定。

沉淀反应：将一系列稀释度的抗原（病毒）和一系列稀释的抗体（抗血清）分别混合，在两者稀释比例适宜范围内可出现沉淀物，此即为沉淀反应。此类反应如：微量沉淀反应，琼脂双扩散反应，及免疫电泳等，都是在植物病毒检验中最常见的血清学技术。

凝集反应：把病毒的抗体先吸于一种与免疫无关的颗粒表面，然后使其与相应的抗原结合而出现的凝集，即为凝集反应。常用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、炭末、血细胞、A蛋白等。

抗体标记：对抗体用荧光素、酶或同位素等进行标记，然后通过对标记物的检测追踪抗原，常用的有酶联免疫吸附、荧光免疫、同位素免疫实验等，这类检测技术灵敏度极高，适于对微量抗原的检测。

现将在植物检疫中常用的几种血清学技术介绍于下。

1.微量沉淀反应

在溶有抗原的溶液内按适当比例加入抗血清时，抗原与抗体互相结合而沉淀。其方法如下：

（1）用蜡笔在培养皿底部各划8条横竖线形成方格。

（2）取两排小试验管，每排7～8个，一排用于抗原，一排用于抗血清，每试管中加0.2ml的缓冲液。

（3）制备1mg/ml纯化病毒原液，在抗原稀释排中加0.2ml原液于第一试管，用1ml的移液管再从中吸0.2ml移至第二管，然后再移0.2ml于第三管，一直移到最后一管，各管的稀释度分别为原液的1/2至1/128。

（4）在小试管中加1.5ml含0.025%防腐剂NaN3的缓冲液，在缓冲液内混入0.1ml未稀释的抗血清，制备出1/16稀释度的抗血清作为原液；在第二排的第一试管中加0.2ml的原液，混合后移0.2ml至第二管，如此一直到最后一管，制备出1/32～1/2048的稀释系列的抗血清。

（5）用微量移液管从抗血清最高稀释度（1/2048）开始，在培养皿的第七横排的每个方格滴加1滴，同样将1/1024稀释度的抗血清加到第六横排，这样将板上所有的方格均滴加各种稀释度的抗血清。

（6）用另一移液管从最稀的抗原液开始，在第七纵排每方格内滴加1滴，按同样方法在第一至第七纵排各方格内滴加各种稀释度的抗原。在所有第八横排和纵排的方格内滴一滴缓冲液做对照。随后在反应液滴上复盖一层液体石蜡油防止蒸发。

（7）将制备好的培养皿在室温湿润环境下孵育2h后，在暗室用双目解剖镜观察，然后在普通冰箱内过夜，第二天继续观察结果，此时沉淀已清晰可见。

以最浓的沉淀为四，以下逐渐减弱的梯度分别记为三、二、一，以三为抗原最大稀释度和产生沉淀的最小血清用量，作为抗原抗体最适比例

微量沉淀技术测定抗原抗体最适反应浓度表

（8）实际测定时，用最适稀释度的抗血清与其相应的抗原和异种抗原进行反应，或用最适稀释度的抗原与其相应的抗血清和异种抗血清进行反应，均可观察它们间的血清学关系。如表0-4-2所示，

微量沉淀技术测定多种抗原间血清学关系表

各供试抗原的稀释度为1.56mg/ml，与1/4至1/1024的不同稀释度的抗血清反应结果表明，第一、二、五、六、七横排的抗原与抗血清的相应抗原是相同的，第三、四两排抗原与抗血清的相应抗原虽然不同，但有一定亲缘关系，第八、十排抗原则与抗血清的相应抗原有远缘关系或无血清学关系，第九排的抗原则完全无关。

2.琼脂双扩散试验

琼脂凝胶的含水量极高，允许分子质量20万u以下的大分子物质自由通过，绝大多数的抗原和抗体分子质量都在20万u以下，在琼脂凝胶中的运动所受阻力甚小，可自由扩散，免疫双扩散就是应用这一原理，在一块琼脂凝胶板上打几个小孔，分别置入抗原及其相应抗体，抗原与抗体分别向凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度最适比例处，形成肉眼可见的抗原抗体结合物的沉淀带，带的大小形状数量和密度决定于所测试的抗原抗体的特性。本法适于检测植物粗汁液、澄清液和高度纯化的抗原。试验时需设置健康植物汁液及标准抗原作为阴性和阳性对照。本法的特点是可同时检测一种抗原对多种抗体，或一种抗体对多种抗原间的血清学关系，对病毒的鉴别极为方便。缺点是灵敏度较低，抗血清用量大，检测时间长。具体检测技术如下：

（1）称取琼脂加入适当的缓冲液中，用水浴或微波炉加热至琼脂溶解，按0.1%加叠氮化钠。置培养皿或玻璃平板于水平台面，当琼脂冷却至60℃时，倒适当量于板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。静置至凝固。

（2）将模式图置于板下，用打孔器打孔，挑除孔中琼脂，孔的排列有多种形式，常用的排列，由一个中央孔和周围六个孔组成，孔的直径7mm，周围孔与中央孔的距离为3～4mm。

（3）用缓冲液或生理食盐水在小试管中稀释抗原，在周围孔中加最适稀释度的抗原，在中央孔中加最适稀释度的抗血清。外围孔中加倍比稀释系列的抗原，中央孔加倍比稀释系列的抗血清，产生致密狭窄的沉淀线的组合为最适浓度。

（4）将培养皿在保湿环境下进行孵育，次日在暗背景下观察沉淀线出现情况。在印有排列模式团的纸上，图记沉淀线的形式，沉淀线图形可用照相或染色保留。

（5）结果的判断：根据沉淀线的形状分析抗原与抗体，及抗原互相间的关系。

对长形病毒进行琼脂双扩散检测时，可在琼凝胶介质中加入十二烷基磺酸钠（SDS），此剂为一种阳离子表面活性剂，可将病毒裂解成具有抗原活性的可扩散的片断利于检测。

3.对流免疫电泳

在以琼脂凝胶为介质的情况下，免疫球蛋白带有微弱负电荷不能抵消电渗作用，故在电泳时向负极迁移，而一般抗原蛋白带有较强的负电荷，抵消电渗后仍向正极迁移。依此设计的对流免疫电泳是将琼脂电泳与免疫沉淀相结合的方法，将抗原病毒放在琼脂凝胶靠近阴极一侧，抗体放在靠近阳极一侧，在直流电场中，抗原迁向正极，免疫球蛋白迁向负极，相遇后形成免疫沉淀线。具体技术如下：

（1）凝胶床的制备。取定量琼脂粉用蒸馏水浸泡2～3d，每日换水1～2次，用硼酸缓冲液配成1%～1.2%的琼脂液，加0.1%叠氮化钠。将玻璃放在水平台上用吸管将缓冲液琼脂注到板面，制成2mm厚的凝胶床并打孔。

（2）将制好的凝胶床放在电泳槽内，加缓冲液（用配制琼脂凝胶的缓冲液稀释1倍）离床面2～4cm，在琼脂板阴极一端孔中加入抗原，在靠阳极一端孔中加入特异性抗血清，在琼脂床的两端用两层纱布使琼脂板与电泳槽中的缓冲液相连，进行电泳。

（3）进行电泳时，电压、电流和时间，根据缓冲液离子强度、电泳床大小和抗原性质而有所不同。只要不使病毒抗原变性，尽量保持较高的电压，如电流超过2mA，电泳应在低温下进行。

（4）电泳完毕后，将电泳板放在黑色背景处观察，也可将电泳完毕的琼脂凝胶板先浸在生理食盐水中30min，然后放在苦味酸溶液中20min，可将背景染成黄色，沉淀为白色，便于观察。

免疫电泳与琼脂双扩散相比有三个优点，快速、灵敏并可用于在琼脂中扩散慢的长形病毒。

4.乳胶凝集试验及A蛋白乳胶凝集试验

用特异性抗血清提纯的免疫球蛋白，将其吸附在乳胶粒子上，制备抗体免疫球蛋白致敏乳胶。当与相应的抗原相遇时即可产生凝集反应。这是一种灵敏度高特异性强的血清学技术，但是每次都要特异性抗血清提取抗体γ球蛋白，制备手续繁杂不便应用，如直接用抗血清致敏乳胶则显着影响效果。其后Querfurth（1979）发现A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影响与相应抗原结合。这样就可先使A蛋白与乳胶粒子结合，再与抗血清中的免疫球蛋白结合，形成A蛋白-乳胶-免疫球蛋白的复合体。这种乳胶凝集试验可简化致敏免疫球蛋白的过程，而获得同样效果。具体做法如下。

（1）免疫球蛋白致敏乳胶的制备。

将特异抗血清用33%饱和硫酸盐析法提取球蛋白，悬浮于0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）缓冲液内，取10%空白乳胶稀释15倍后与等量适宜浓度的球蛋白液混合，置室温2h后移入冰箱内过夜。经低速离心（7000r/min，20min）取沉淀悬浮于缓冲液内，经反复离心洗涤2次后将最后沉淀物悬浮于缓冲液内即可得抗体球蛋白的致敏乳胶。

（2）A蛋白乳胶致敏抗体的制备。

将市售A蛋白溶于0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸缓冲液内，制成A蛋白溶液，与等量稀释15倍的空白乳胶液混合，置室温3h，移入冰箱过夜。低速离心（7000r/min20min）后将沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液，反复离心洗涤2次，沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液制备A蛋白乳胶溶液，与等量适宜稀释度的抗血清混合，置室温下3h后移入冰箱过夜。再反复离心洗涤2次，最后将沉淀悬浮于与抗血清等等量的甘氨酸缓冲液内，即可得A蛋白乳胶致敏抗体。

（3）检测法。

用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀释抗原，制成20、40、80、160、320、640、1280的系列浓度，在一洁净玻璃板上，用笔画好方格，每格加2滴不同稀释度的抗原，然后再加1滴乳胶致敏抗体（或A蛋白乳胶致敏抗体）用微量血液振荡器以120r/min振荡混合后，用肉眼或10～25倍解剖镜观察结果。同时设空白乳胶液和健汁液对照。

阳性反应表现有明显的絮状或颗粒状凝集物，背景清明透亮，阴性反应则仍为均匀的牛乳状液。也可用浊度计检测其凝集度。

此法受健康植株蛋白的干扰较小，适于直接采自病株的澄清液，不但适合球状病毒，对杆菌状病毒，棒状病毒，线状病毒也适用，并有较高的灵敏度。但对效价低的抗血清或含有乳状胶体的植物不适用。

5.酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原或抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助标记在抗体上的酶与底物所产生的颜色，检测相应的抗原。此法灵敏度高，特异性强，快速简便极适宜植物检疫应用。常用的检测方法有以下几种：

（1）直接法。

将待测样品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板内，保温后洗涤，使附着于壁上的抗原与加入的酶标抗体γ球蛋白反应，洗涤后保留与抗原结合的酶标γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度计进行检测。

（2）间接法。

先用抗兔球蛋白山羊抗体与酶结合制备酶标记抗体，将待检抗原包被于固相载体，经过孵育洗涤，加入特异性兔抗血清，孵育洗涤后加羊抗兔酶标记抗体，孵育洗涤后加入底物，观察结果。

（3）双抗体夹心法。

先将特异抗体免疫球蛋白包被于固相载体，保温洗涤后，加待测抗原，使与吸附于载体上的抗体反应，保温洗涤后再加入特异抗体的酶标记物，最后加底物观察反应结果。

（4）A蛋白酶联法。

将A蛋白用pH9.6的甘氨酸缓冲液稀释后包被微板，加入特异性抗血清，使其与已固定在微板上的A蛋白结合，再加入待测抗原使其与特异性抗体反应，再加入特异性抗体，使其与抗原反应，再加酶标记A蛋白，最后加酶的底物测其光密度值。

（5）异种动物双抗体夹心法。

先将第一抗体（兔血清抗体）包被微量反应板，加待测抗原后，加适宜浓度的第二抗体（鼠腹水抗体），再加入市售羊抗鼠酶标记物，最后加底物观察反应，一般8h即可得出结果。此法保持了双抗体夹心法快速准确灵敏度高的特点，对球状病毒、杆状病毒、线状病毒、棒状病毒均可应用。抗体不必纯化可直接使用（但未纯化的抗血清需先选择其最适工作浓度），使用市售酶标记物，可省去制备酶标记抗体的复杂手续，还可克服间接法非特异性反应干扰大的弱点。

（6）生物素抗生物素酶联法。

生物素具有很强的亲和力，是抗原抗体反应的1万倍，两者一旦结合就难以离解，且不受酸碱变性剂蛋白溶解酶及有机溶剂的影响，具有高度稳定性，生物素一经活化可与蛋白质呈偶联结合，即一个大分子可结合多个生物素分子，生物素又可大量结合在酶标记物上，使酶标记物成为多价，而抗生物素本身又是一个多价分子，每一亚基均可结合一个生物素分子，因此，这种方法可产生多级放大，使灵敏度提高10倍以上，并降低非特异性反应，把酶联免疫吸附技术又提高一步。具体方法如下：

先将第一特异抗体（兔抗体或鼠腹水抗体）包被在固相载体，加待检抗原，加第二特异性抗体（鼠腹水抗体或兔抗体），再加入相应生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶结合物，最后加入底物观察O.D.值。

（7）膜上斑点酶联法。

先用软铅笔在一张适宜大小的硝酸纤维素膜上划好边长1cm的方格网，把纤维素膜浸入TBS缓冲液漂洗30min，然后将膜放在两张滤纸之间，在室温下风干，用移液器将抗原抽提液滴在各方格中央，室温下风干，用TBS-T缓冲液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出后放在滤纸上至膜表面水滴消失，然后浸入封闭液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保温1h，取出晾干后，浸在用封闭液稀释的第一抗体溶液，在37℃下保温1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min换液一次。将膜浸入稀释度1/200的酶联球蛋白，室温保温1h，用上法洗膜后，用碱性磷酸酯酶缓冲液冲洗两次，每次10min，将膜浸入酶底物溶液内，室温下避光5～15min，显色完全后弃去底物液，用终止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜于滤纸内彻底风干后观察结果。

此法可克服塑料板的不足，只用目测就可对结果定性，不需要复杂的仪器，所需抗原抗体量均很少，灵敏度比常规酶联法高10倍以上，适合大量抗原的检测。

6.免疫电镜

电镜检测可快速确定病毒粒子的形状，是鉴定病毒不可缺少的技术，但有的样品浓度很低，用普通的电镜技术不易观察，如将病毒粒子包被后，抗体可把病毒粒子捕捉成聚集物便于观察。同时还可从病毒粒子与抗体的结合情况，观察两者间的血清学关系。通常使用的有以下几种方法：

（1）叶片浸沾血清技术。

把一滴稀释的抗血清，滴在有膜的铜网上，将叶片的新鲜切口浸入血清滴中1～2s，置于室温下5～10min，使血清与相应的病毒聚集并装饰起来，再进行负染检镜。

（2）Derrick氏法。

把火棉胶膜铜网在24℃下，置于按1∶10比例稀释于Tris缓冲液的抗血清内，然后将铜网用缓冲液冲洗后使用。把病毒的粗提液稀释于含HCl的Tris缓冲液内，将已用血清包被的铜网浮于0.1ml的病毒稀释液内1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水冲洗，然后干燥喷镀。

（3）聚集法。

把抗血清用磷酸缓冲液稀释到1/100的浓度，取10μl滴于载玻片，将切成2mm见方的病叶在血清滴中压碎，在湿室中保湿15min，用镊子持有膜铜网蘸取液滴，用20倍磷酸缓冲液冲洗后，再用蒸馏水洗，最后用5滴醋酸氧铀染色观察。

（4）修饰法。

取2mm见方的病叶在载玻片上的10μl蒸馏水中压碎，持有膜铜网沾此液滴，将病毒粒子吸附于铜网上，然后将铜网用20滴的磷酸缓冲液冲洗，吸去水分后加1滴稀释成1/100的抗血清，在湿室中保湿15min后，将铜网用20滴磷酸缓冲液和30滴蒸馏水冲洗，最后用醋酸氧铀染色检镜。

（5）诱捕修饰法。

先将铜网用稀释1/10或1/100的特异性抗血清包被，再把病毒样品滴于铜网，保湿15min，用缓冲液及蒸馏水冲洗吸干，再加1滴稀释成1/100的特异性抗血清，孵育15min后，用缓冲液和蒸馏水冲洗，吸干染色检镜。

（6）羊抗兔血清诱捕修饰法。

在诱捕修饰法未染色以前，再加1滴稀释1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗涤后染色镜检。此法因病毒粒子外壳包被有两层血清，明显加粗，在2000倍的低倍电镜下即可清晰地看到病毒粒子。

（7）A蛋白诱捕修饰法。

在福尔马膜的铜网上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育后洗去多余的A蛋白，再包被稀释100倍的特异性抗血清，滴加抗原，再滴加特异性抗血清，最后染色镜检。此法比一般诱捕修饰法灵敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

2. 病毒的血清学技术有什么作用

这是检测病毒的有效办法。血清学诊断和鉴定病毒的方法很多，常见的有ELISA（酶联免疫吸附法）、免疫电镜、琼脂双扩散、免疫电泳等。其中，ELISA（酶联免疫吸附法）为世界公认的植物病毒检测方法。应用抗血清鉴定植物病毒的亲缘关系，检测花卉的种子、鳞球茎和苗木中传带的病毒，是植物病毒检疫和检测上常用的快速鉴定和检验技术，经常和生物学、电镜技术等配合使用。

血清学反应的原理是人或高等动物对于侵入自身的有些异体物质产生免疫反应，即异体物质刺激淋巴组织产生相应的球蛋白称为抗体，能刺激机体产生抗体的异物称为抗原，抗原与其相对应抗体可以在机体内或机体外进行特异性反应，这种反应可以被用来预防疾病（人或动物）、鉴定和检测病原物。

抗原的分子具有许多化学活性基团，称为抗原决定簇，它们的一定结构决定了抗原的特异性。一般来说，抗原决定簇数目愈多，抗原性就愈强。植物病毒是核蛋白，外壳由许多亚基组成，抗原决定簇位于亚基上。植物病毒是良好的抗原，其蛋白外壳，尤其是外壳的表面起着抗原的作用；单链核酸虽不能作为抗原，但它与外壳蛋白同时存在时，能增强外壳在动物体内的免疫反应；一般来说，植物病毒比其寄主的正常植物蛋白有更强的抗原性。

抗体是动物机体受到抗原刺激后，由动物机体的免疫活性细胞产生的免疫球蛋白，通常以“Ig”来表示。在抗体中至少含有5种免疫球蛋白，即IgG，IgM，IgD和IgE，其中以IgG最主要，约占70%～90%。IgG为易弯曲的Y形分子。由4条多肽链（2条重链和2条轻链）借4个2硫链连接组成。链的一端为氨基端，另一端为羧基端，酶可以降解IgG成为断片。常用木瓜酶和胃酶。前者将IgG降解成Fab和Fc两种片段；后者降解为F（ab）2和FC两种片段。Fab片段有抗体活性，1个Fab与1个抗原分子结合；F（ab）2为双体，可与2个抗原分子结合。抗体存在于免疫动物的血清或体液中。

植物病毒的抗血清，是将病毒的提纯液作为抗原，一般以家兔，有时也以小鼠或母鸡等为免疫动物，通过静脉、肌肉或腹腔等途径，逐渐增加剂量，多次注射抗原。待抗体产生后，采血，取出其血清即为该病毒的抗血清。免疫家兔产生的抗血清称为兔抗体；免疫小鼠产生含特异抗体的腹水，采收的腹水，内含“腹水抗体”；免疫母鸡，产生含抗体的鸡蛋，从蛋黄中提取的抗体称为“蛋黄抗体”。运用细胞融合技术，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞杂交，产生杂交瘤细胞，其增殖能力很强，可在体外连续培养产生抗体。选择其中能产生某单一抗体的细胞株，所产抗体称“单克隆抗体”。单克隆抗体开创了在动物体外产生抗体的新时代。

这里介绍几种常用的血清学检测技术。

1 免疫双扩散法

又称奥氏琼脂双扩散法。琼脂在水中加热溶解，冷却时成为凝胶平板，在上打数孔，分别放入抗原和抗体，它们各自向凝胶中扩散，于抗原和抗体比例最适的位置上形成沉淀反应。

具体步骤：按每1～2g（一般用1.2g）琼脂粉，于100ml生理盐水中，置沸水浴或家用高压锅中溶化，配成1%～2%琼脂，加0.1%叠氮化钠，防腐，用吸管或其他物品，将琼脂均匀地铺于洁净的玻璃平板（可用载玻片或裁制成的大小一致的玻板）上，以热的琼脂液刚铺满为限，约1.5～2mm厚，静止待凝固，制成的琼脂板置保湿器皿中待用。检测时，琼脂板下放一“孔排列图”，用打孔器按图样打孔。孔的排列方式很多，有梅花形，有7孔，即中间1孔，四周6孔；方阵形，有5孔，即中间1孔，四周4孔（图1）。打出孔后，用针或吸器将孔中凝胶圆片取出，在孔中加适宜稀释度的抗原或抗体，抗原孔中应包括已知阳性抗原、待测抗原和健株对照，可以用病健株的汁液或提纯病毒液。加满各孔，持平放于保湿器中数小时或放置至次日，在有黑背景的散射或斜射灯光上方观察沉淀线。抗原和抗体的适宜浓度是影响反应结果的主要因素，因此必须注意：第一，孔径和孔距（相邻两孔边的最短距离）要适宜，两者之比以2∶1为宜，即孔距等于孔的半径，孔距过大，沉淀线便不能出现或变模糊，并且反应时间拉长，不能很快见到结果；第二，掌握反应物的最适浓度，为此，对所用抗体或抗原，分别作倍比稀释，先测知两者反应的最适浓度后，再进行正式反应。

图1 打孔图样