超氧化物歧化酶(SOD) 超滤法生产新工艺
前 言
SOD的中文名称是超氧化物歧化酶，其英文名为Superoxide dimutase，分子量(牛血红细胞) 约 32000 是广泛存在生物体内的金属蛋白醇 ， 别名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科学家誉为21世纪最有发展前途的药用酶。
一、本工艺是从红细胞，肝和其它哺乳动物组织分离而得的金属酶；含两个亚基，每个亚基各含一个铜原子和一个锌原子，SOD可催化O2，歧化为H2O和O2， 其性质不仅仅取决于酶蛋白，而且还取决于活性部位的金属离子，按金属离子类型不同， 可分为Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三种.在一般条件下，SOD较稳定. 不同来源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光谱略有差异，如牛血SOD在258nm处显示最大吸收，而猪血SOD的最大吸收峰为265nm，在特定条件下，酶的活性可下降，甚至完全丧失， 如氰化物可抑制SOD活性，双氧水使SOD活性下降，氯化胍能明显抑制SOD活性等。
二、SOD用途主要是基于SOD是超氧阴离子清除剂，超氧阴离子(O2~)是人体内有毒物质，它能引起多种疾病，故能清除炎症过程中伴同产生的超氧离子， 而显示出强大的抗炎作用。
在医药工业：SOD可以治疗由于超氧离子引起的各种疾病，如糖尿病，白内障， 风湿性关节炎等，也是消炎的有效药物，而且还能抗衰老，抗肿瘤，抗辐射， 抗自身免疫疾病，现代研究表明：SOD还能治高血压，冠心病，胆囊炎，肺气肿等难治之症. 日用化学工业：由于SOD有防止细胞老化和解毒等功效， 因此在化妆品和护肤剂等工业产品中，添加SOD之后，具有防晒，祛斑，使皮肤柔嫩的作用.是目前化妆品行业中不可缺少的一种添加剂，国内及同行都已出现大量产品.食品工业：在食品添加剂加 SOD之后，增强营养，解除毒性，延长体内细胞寿命，国内已有SOD营养液产品， 并通过上海科研单位有关专家的鉴定。
三、SOD的开发前景：目前SOD在全国仅有少数科研单位及生化制药厂研究和开发本产品，而使用SOD产品厂家却日益增多，远不能满足市场需求 . 为鼓励和大力开发SOD新产品，国家已将其列入重点科技开发项目，并投放大批经费，现已获得成功， 开始向企业化生产转移，市场前景十分广阔。
四、注意事项：(1)我中心热忱欢迎社会各界朋友现场学习，由生化工程师向您授课，通过现场操作，指导，培训，使您尽快掌握该技术。(2)本工艺， 技术资料等不经我公司同意，不得擅自转让，翻印，销售给任何单位和个人，违者法律追究。
新法提炼技术
一、主要设备：(1)工业用离心机一台；(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台；(3)冰柜1台；(4)搅拌机1台；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml烧杯各3只，50ml烧杯 2 只，50ml，500ml量杯各1个；(6)塑料桶若干个。
二、主要试剂：(工业纯度)柠檬酸钠，柠檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，去离子水或蒸馏水，葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.
三、试剂的配制：
1.抗凝剂配方：(1)柠檬酸钠30g，柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，一般此种是每7ml血液，加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液：在1升水中加入0.9克的氯化钠。
2.生理盐水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠。
3.磷酸盐缓冲溶液的配制：PH7.6，0.2M磷酸盐缓冲溶液，一般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液，如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升，NaH2PO4.2H2O为31.21克/升，仍是前者87.0ml，后者13.0ml混合后即得。
4.冷却剂：在本工艺中有使用-15度低温，一般用如下配方：用33克食盐加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合体可达-21.3度。
四、工艺流程
(一)除血红蛋白
1.血液抗凝处理，在新鲜牛、马、猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂，并缓慢搅匀，每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂。
2.把抗凝处理的血液放入离心机，以3000r/min离心约15--20分钟， 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉，下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次，在每一次洗涤中，用离心机以3000r/min离心，7--8分钟，反复操作后，得到洗涤血红细胞，洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活，在血液量大， 处理不完时必须这样做。
3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30分钟，使红血球细胞壁砍碎，以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后，把溶血进行有机提取。
4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿，搅拌10--15分钟后，原溶血呈浆糊状，静止1--2小时，用滤布除去凝固的血红蛋白，然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀， 此时如果上清液略为微黄色时，可用快速过滤纸过滤，可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液。
(二)粗酶液的初步提纯：
1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沉淀 ， 以3000r/min离心2分钟收集沉淀，上清液可不必吸取，直接倾倒。
2.热变性：(除杂蛋白)准备好衡温浴锅，在本工艺中，提前30分钟， 注满水接通电源后，使之加热到55--60度以省时间，将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液，水浴加热至60度，15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液，在上清液中，缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮，生成白色沉淀。
3.初纯SOD：在上述沉淀中加去离子水，制成20--30%SOD溶液，分装入样品瓶中，放入冷冻干燥机中，于开机后以0.2--0.1Torr真空度，约1.5--2小时， 得到化妆或食品用SOD，该产品比活大于3000u/mg，外观呈微带蓝色的白色冻干品。
(三)SOD进一步提纯：
SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析，柱层析后的SOD没有小分子等杂质， 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高，它主要作为生物化学试剂， 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种，二者可单独使用，也可结合使用，一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析，将(二)2，热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解，有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀，上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脱 ， 洗脱液为PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4缓冲液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液，合并活力峰，再用蒸馏水反复透析，透析彻底后， 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品。
五、注意事项：
1.掌握适当的温度和时间：虽然SOD对热较稳定， 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度，一般以0--10度为宜，时间长不要超过3天。
2.注意提取，提纯方法：使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质， 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果。
六、SOD的检测方法：活性检验，比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法， 先测得连笨三酚的自氧化速率，然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率，按照酶活性单位定义，即在最佳条件下，每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ，同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度，看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.
超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。
自1969年Mccord和Fridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，1988年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。
SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过20种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。
我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。
本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为CuZu-SOD。
一、药品与仪器：
(1)柠檬酸三钠：Na3C6H6O7 (2)工业丙酮CaH6O
(3)邻苯本酚 (4)酸磷钾K3Poe4
(5)弱碱性阴离子交换剂DEAE Sephadsxa-50外观40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纤维素。 (6)冷冻干燥器(自己组配)
(7)层折柱(7.5＊30cm) (8)离心机
以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购买。
二、Cu、Zu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)
1、工业流程：
加抗凝剂 盐洗
鲜牛血--------------------->红血球------------------------>
离心除黄色血浆 加NaCL
热变性1 热变性2
压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->
68度30分钟 60-65度20分钟
加丙酮 加丙酮 层析
浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>
冻干
透析除盐
洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)
2、提取方法
(1)收集红细胞：鲜牛血100升，加入3. 8％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入3倍量0.9％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(40升)。
(2)热变性1：收集的红细胞再加入4公斤氯化钠，40克氯化铜，蒸馏水100升搅匀，水浴加热到68度恒温30分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。
(3)热变性2：滤液在65度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入40克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温20分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。
(4)SOD粗品：超滤心清液加入0.75倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品
(5)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于2.5mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液，将该混合液上在7.5＊30cm的层柱上，离子换剂为DEAE-SphadexA-50(该柱事先用缓冲平衡)，以100～200ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲A280mm值，低于0.02然后用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为100ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。
三、SOD活性测定：
SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器
(1)邻苯本酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：
(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：
测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min
----------------------------------------＊100％度
0.70
样液稀释倍数 样液稀释倍数
酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------
50％ 样液体积
3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：
SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：
单位活力(u/ml) 总活力
比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白
蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白
四、Cu、Zn－SOD性质：
1、Cu、Z n－SOD呈蓝绿色，分子量在3200左右，由两个中一个Cu和一个Zn。
2、对热稳定，天然牛血SOD，75度下加热数分钟其酶活丧失很小。
3、PH值对SOD的影响，SOD在PH5.3～10.5范围内，其催化速度不受影响，PH3.6时SODZn脱落95％，PH12SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。
4、SOD的紫外线吸收特征：SOD在280mm处没有吸收高峰。
5、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Zn仅于分子结构有关，而Cu与催化活性有关。
6、SOD是其具有还有和失活作用的。
五、药品与仪器：
柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；
工业丙酮：上海溶剂厂；
邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；
六、SOD的包销单位：
(1)河南郑州国营圣科研究所郑州南阳路14号 邮编：450053《河南科技报》91年10月3日
(2)四川省金堂县工艺制品技校生化科接待室：金堂准口执行的院内，政府办公大楼1楼 邮编：610404 联系人：邓勇 彭丽 《四川农村报》 91年3月1日
(3)广东省深圳市上步区石夏东二苍14号科技所 邮编：518031联系人：黄秋林 《科技消息报》92年7月10日
说明：1、资料后附的产品销售地址信息均为我们从近两年的报刊上摘录的各单位广告，并注明有出处。
2、你先看完资料后，行根据自己的实际情况，先小量试验， 并事先联系好产品的收购单位，待取得经验后再批量生产。
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附：详细SOD收购信息
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电话：010-68150495，68212139
传真：010-68212015
地址：北京市石景山区吴家村华电集团大楼三层
通讯：北京市石景山区40-021信箱
邮编：100040
㈡ 护肤品中植物成分的功效
不同的植物提取物起不同的作用啊，
抑菌止痒
常见的抑菌止痒的植物提取物有茶叶提取物、金银花提取物、芦荟提取物、甘草提取物、川芎提取物、薄荷叶提取物、鼠尾草提取物等。
保湿滋润
保湿类植物提取物能滋润柔软皮肤角质细胞，有助于皮肤处于润湿、柔软状态。常见有海藻提取物、柠檬提取物、燕麦提取物、芦荟提取物、益母草提取物、绞股蓝提取物等。
美白祛斑
利用中医药理论配方需要将传统理论和现代分析技术相结合，将茯苓、丹参、当归、益母草和人参可以起到非常好的美白祛斑的效果。这主要是因为丹参含有多种丹参酮及维生素E，能活血化瘀，疏通面部血脉，淡化色素斑；当归含有多糖、维生素B、维生素A和多种植物酸等，一样有活血淡斑的效果；人参含有30多种皂苷、多种氨基酸、维生素及微量元素等成分；益母草含有多种生物碱、月桂酸等物质成分，可以调节人体各种机能。常见的具有美白祛斑功能的还有活性木瓜素、当归提取物、桔梗提取物、柠檬提取物等。
防晒作用
这类植物提取物是天然的紫外线吸收剂，其对紫外线的吸收波长极大值在280 nm左右，所以能防止紫外线对皮肤的损伤，一般搭配物理防晒剂使用。常见有当归提取物、槐花提取物、薏苡提取物、紫草提取物、芦荟提取物、母菊提取物等。夏天是防晒非常重要的季节，因此这类提取物在美容界是非常受欢迎的。
抗皱纹抗衰老
罗汉果提取物，红景天提取物，巴科罗汉果提取物保留植物中抗氧化性的成分，养肤美容。