1. 简述鸡新城疫病毒的分离鉴定步骤。
（1）病料的采集和处理可采集病鸡呼吸道分泌物、脾脏、血液、脑组织，按1：5的比例假入灭菌的生理盐水或缓冲液，用研磨器将组织研碎制成20%的悬液，反复冻融2-3次，5000r/min离心20分钟，取上清，用灭菌滤器过滤除菌或加抗生素杀灭病料中杂菌。
（2）分离培养将处理好的病料经尿囊腔接种9-11日龄无母源抗体的鸡胚，37℃孵育，每天照蛋2次，弃除24小时内死亡胚，收集24-96小时死亡胚，96小时内未死亡胚取出。
（3）收集鸡胚尿囊液采用血凝试验检查是否有血凝活性，对有血凝活性分离物应用标准的抗新城疫病毒，采用血凝抑制血清学试验对病毒进行鉴定。
确定为新城疫病毒后对病毒的致病性做进一步鉴定--致病性试验。
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3. 如何对新城疫病毒感染的病鸡进行微生物学诊断
微生物学诊断
（一）病毒的分离
1．鸡胚分离法。
2．细胞培养分离法 将经过处理的检样材料接种于鸡肾单层细胞或鸡胚成纤维单层细胞上，经过35～37℃孵育2d，观察单层细胞上出现的蚀斑
（二）血清学试验
1. 红细胞凝集抑制试验（HI） 应用已知鸡新城疫病毒来检测病鸡体内的抗体。病程5～6d以上者，血液有抗体产生，病程10d以上者，其抗体效价可达1:1280或更高，所以应用已知病毒来测定可疑血清的方法更有实际意义。
免疫与治疗
严格按照免疫程序接种。雏鸡10～12日龄首免,用Ⅳ系苗点眼和滴鼻；25～30日龄二免,用Ⅳ系苗饮水免疫；60～70日龄三免,用Ⅰ系苗或油乳剂灭活苗0.5ml皮下注射,以后每隔半年加强免疫１次。
4. 流感新城疫抗原胶体金试纸的使用方法
提要：本文主要介绍禽流感新城疫抗原胶体金试纸的使用方法，并就具体操用、判定认知和试纸本身检测等生产实际中常用的一些问题进行了探讨。
关键词：禽流感新城疫胶体金试纸 操作野毒 疫苗毒 检测
禽用禽流感新城疫抗原胶体金快速诊断试纸相比于传统的诊断方法具有很多优点，一经推出便受到了较好的应用。其准确及时的诊断能为疾病的防疫和控制争取了到宝贵的时间，许多养殖场、种禽场也因此避免了因无法及时确诊疾病所带来的不应有的损失。试纸条的主要优点如下：
1、快速。十几分钟就能快速捕捉相关病毒，确定疾病。而酶联反应法（ELISA法）和基因扩增法（PCR法）则需要几个小时以上。
2、灵敏。好的产品灵敏度最低值是3×103EID50/ml，而感染禽流感或新城疫的家禽排毒量常在108EID50/ml以上。所以完全可以满足广大基层生产和诊断实际需要。
补：通俗地说，一般试纸的灵敏度高于0.25个血凝单位。其中使用的单克隆抗体对不同的毒株会有不同的结合度，比如对于KR1的流感毒株的灵敏度就是0.031个血凝单位，而对于分型的毒株的单克隆抗体，其灵敏度就是0.062个血凝单位。不分型的单抗是针对核衣壳蛋白的，而分型用的单抗则是对于血凝素上的某个位点的。对于野毒来说，大部分的灵敏度仍高于0.25个血凝单位，分型的试纸高于0.5个血凝单位。
有许多朋友问这个东西准不准，实际上它与早孕试纸使用差不多，没有几个人怀疑早孕试纸的准确性。这个试纸主要的问题在于研发时的难度比早孕试纸大，使用起来差不多。
3、及时。由于是捕捉病毒，所以不但在疾病前驱期和症状明显期能够测到，在潜伏期排毒时就能检测。能将诊断疾病的时间大大提前。而抗体测定则要晚几天到十几天，才能测到抗体的变化。这对快速发病的高致病力禽流感和强毒株新城疫病来说就太晚了。而且由于禽流感毒株的变异，常使新的毒株能够避开疫苗产生的抗体的攻击（免疫逃逸）而使家禽养殖场在疫苗抗体很高很好时遭受巨大的损失，而这一变化在抗体测定上常反映不出来。
4、简便。携带方便操作简单，田间野外也可进行操作，且不需要专门的仪器。不象ELISA和PCR方法需要价格不菲的仪器、专门的实验室和专业的培训。
5、价廉。成本低廉，从几元到几十元不等。一栋5000只的鸡舍一般使用一两条即可。
6、稳定。试纸2～30℃常温保存一般在一年半以上。好的产品保存期长达两年以上。
7、面广。鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、孔雀、鹌鹑等大部分家禽都能测定。可采集的样本有气管液体、肠道内容物、泄殖腔内容物和经处理的脏器组织等。
但是试纸作为新出现的高科技产品在使用过程中，仍有一些需要注意的问题。下面从具体操作、判定及判定认知和试纸本身检测三个方面就遇到一些问题进行探讨，以期达到抛砖引玉的作用。
一、 试纸具体操作上的一些问题
（一）、正常操作步骤
目前一套完整的试纸常分两种：一种是一条试纸、一个含病毒洗脱液瓶的洗液瓶、一个吸液管、一个棉签；另一种其它一样，只是在功能上将洗液瓶和吸液管合并成一个可以做滴液瓶的组合洗液瓶，其瓶盖上有一个可折的下部中空的小杆，打开后反转洗液瓶即可做滴管。正常的操作步骤如下：
1、用棉签在合适的地方（气管、肠道、泄殖腔等处）取样。
2、将样本插到装有洗脱液瓶中并加以搅拌。盖好瓶盖并加以摇晃，使病毒尽量从样本中释放到洗脱液中。
3、用吸管吸取上部较清液体，滴到试纸的滴孔处。陆续滴4～5滴。如果是可作滴管的组合洗液瓶，则掰开瓶盖上的小杆，露出小孔反转小瓶作滴管用。
4、30分钟内观测结果。
（二）具体使用中的一些技巧
1、采样要求
鉴于家禽排毒量与日龄常呈正相关，日龄越小排毒量相对越少。所以建议六十天以下的小鸡剖检取样，六十天以上鸡可以通过泄殖腔采样。从已死亡的家禽身上取样时要注意，气管采样不取痰，只在气管清亮处或病变部位采就行。在十二指肠、小肠中段卵黄蒂周围取样时，要用剪子轻刮一下打开的肠道面，在暴露出的肠道淋巴滤泡肿胀、出血和溃疡的部位取样就行。
因为试纸本身是捕捉病毒的，所以只取眼观发病或病死家禽就行，不用象测抗体那样，按比例随机抓家禽。试纸初始设计是一条试纸测一只家禽，实际应用中可以一条试纸测3～5只家禽的样本，这样既扩大采样量增加了准确率，又能大幅降低使用成本。就是要注意多次使用的棉签，注意每次采样后要尽量将含棉球部分沿洗脱液瓶转着挤一下，让样本液尽量多留到洗脱液中，又能使棉球再具一定的吸水力以便再采样有效。同时要注意多次采样时，所采样本不要过于粘稠，这样不利于金标在试纸上的流动。如果在滴液过程中发现因此原因而致金标流动不畅，可以在试纸滴孔上加一滴未用过的洗脱液助其流动，同时也可用棉签的另一端在滴孔处轻轻搅几下助样本液渗透。
2、加液要求
一般洗脱液要求加滴4～5滴，不要少加或多加。加少了，金标有时会跑不到试纸的未端；加多了，金标会飘浮，也不利于金标的流动。同时要注意试纸条放置要尽量水平。
3、金标流动
要让金标跑完后再下结论，因为试纸检测上喷涂有捕捉病毒用的单克隆抗体，其本身在硝酸纤维膜上有个高度，会对流动的金标有个阻挡作用，所以不要在金标流动中下结论。既使红色的金标液没有跑完，如有相应的病毒，检测线上会呈现一条直线。不是金标本身流动中头部产生的弯月形的曲线。
现在最新一代的金标试纸采用紫金技术，不再有现行红金技术的红雾和红弯曲线的干扰了。请广大使用者注意技术上的进步情况。
4、病毒量与检测线颜色的关系
检测线上的显示的病毒颜色与病毒的量成正比。色越深病毒越多，色越浅病毒越少。在生产实际中，随着发病家禽经防疫控制后再整体检测病毒，如果抗体上升较好，检测线上的颜色会从最初的较深逐渐变浅，直至消失，即病毒没有了或低于检测最低值了。这时家禽整体状态也会出现很好的恢复。
5、洗脱液与洗液瓶的问题
洗脱液之间配方稍有不同，可以混用，但最好专用。有些兽医想用生理盐水来代替洗脱液，这种想法不行。因为生理盐水洗脱病毒功能较差且没有洗脱液专有的缓冲系统作用和消泡等作用。
采样要求用专配的洗瓶瓶和吸管进行。尽量不要用其它代用品，因为已多次发现有的试验室的器具被病毒污染，尽管多次洗涤和消毒但仍能测到病毒（包括死病毒）的存在，应用这样器具就会出现不应有的假阳性。
6、试纸保存
试纸要求在2～30℃保存，禁止冷冻。
二、试纸结果判定与判定认知
胶体金试纸尽管操作简单，但也有个从不熟悉到熟练的过程。而试纸使用中更主要的问题表现在实验室结果与传统眼观和剖检经验之间的冲突。这类冲突在认知上的解决和整合对兽医诊疗水平的提高具有极大的意义。对于兽医适应养殖业升级的内在要求也有很大价值。
（一）、初期使用
刚开始使用试纸建议用标准抗原或活疫苗来熟悉和观察金标如何捕捉病毒并显色，同时与无病毒对照多次使用直到熟练为至。这种锻炼一是检测试纸灵敏度并建立对产品的信心，二是对后面的田间操作是个很好的基础。
有一部分使用者拿到试纸后直接用于田间测定，结果与通过眼观和剖检预判很一致。很快就能进行熟练掌握试纸的使用和相关的判定工作。但另外许多基层兽医使用者却没有这样幸运，主要问题有以下几种情况：
1、自己认为是新城疫或禽流感，或者眼观与剖检预判“确诊”是这些病时，用试纸检测却什么也测不到；而当自己认为只是轻微呼吸道不会是什么大病时，用试纸却能测到大量的新城疫病毒或禽流感病毒。
2、再一种情况是，与自己的经验严重不符。自己认为是新城疫，结果测出来是禽流感；或者自己认为是禽流感，却只能测到新城疫病毒。
如果连续出现几次这种情况，使用者就会出现两种认识倾向：一是产品根本不准，二是自己平时的诊断是否有问题，甚至怀疑“平时看的此类病例是不是半数都不对？”从本质上说，胶体金试纸实际上属于实验室用产品，出现上述情况是实验室结果与眼观和剖检的经验之间的冲突。如何解决这些冲突呢？
（二）、引起认识混乱的原因与解决方法
造成前述混乱情况有以下几种原因：
1、试纸操作不熟练。这可以通过多练习、多对比、多总结来解决。一般兽医人员经过几次练习就能熟练掌握操作要领。
2、所采样本不合适，没有抓到发病家禽或排毒家禽。这可以通过多抓几只家禽和多测几次来减少失误率。毕竟给家禽看病，是通过几个个体的检测来给群体定病的。
3、至于“自己”通过眼观和剖检所“确诊”的疾病，而试纸检测结果与“确诊”内容不符的情况。首先，确诊疾病是用实验室手段如病毒捕捉、基因测定、病毒分离等手段来验证，而不是反过来，眼观或剖检叫“确诊”。这也是一些“好兽医”心理深处不愿接受的。但这一关过不了。高新产品反而会成为这些兽医断病的一个障碍。
造成此种情况的另一个原因就是，眼见病症明显或家禽处于疾病转归期时，排毒量反而很少或不排毒了，尽管是禽流感或新城疫引起的，但却可能检测不到病毒。一般患症家禽是在疾病的潜伏期、前驱期和证状明显期三个阶段排毒较多，过了这些阶段的家禽排毒反而少了。另外一个情况就是目前家禽都大量做新城疫和禽流感疫苗，其产生的抗体对病毒的繁殖也会有程度不同的抑制作用。但这些可能通过多采患病家禽样本多用几条试纸检测来解决。
还有一个深层次的原因，就是养殖户认为“拿药出钱检测免费”，而兽医门市也不愿多贴钱。双方都不愿为确诊疾病而投入，这就导致实际操作中也不多病例采样本也不搞多次检测，使得检测没有深入进行。这种“重治不重防”的情况在种禽场也大量存在。这也说明我们疾病控制从“重治”转化“重防”不光是资金问题，还有深层次上心理认识和观念认识上的问题。
（三）、解决相关判定认知的意义
我国家禽养殖场已经越过生产与消费正反馈相互促进增长的阶段，进入相对饱和的状态。当前家禽业特别是肉鸡和蛋鸡养殖业已进入“祖代种鸡多、父母代种鸡多、商品代鸡多、消费量反而减少”的“三多一少”阶段，家禽养殖业就要摆脱“小规模大群体”进入“小群体大规模”的升级状态，其对兽医的要求也要大大提高。光凭眼观看病或“一把剪子闯天下”的时代就要结束了，所以积极引进胶体金试纸等新技术提高诊疗水平也是兽医和养殖场技术工作者的一个内在需求了。这也是下一步更激烈竞争的一个重要要求。
（四）、一些数据和问题
从使用试纸检测统计上的数据来看，在近几年检测到的近5000例新城疫与禽流感病例中，70%是新城疫、25%是禽流感H9、5%是禽流感H5。其中极少一部分是禽流感与新城疫混合感染。当然在某一阶段某一种疾病可能占主要数量。
由于家禽大量应用疫苗，就是发现新城疫和禽流感野毒也不一定严重发病，而且在一些抗体正常的种禽场或养殖场仍能检测到新城疫野毒和禽流感野毒的存在。变异病毒一旦出现免疫逃逸常会使养殖业造成极大的损失。
一些养殖场常在感染禽流感时习惯性地做新城疫疫苗，往往造成较大损失。也有一些门诊兽医将禽流感当新城疫“治”，让养殖户打Ⅰ系苗，结果造成大量死亡，引起较大的“医患纠纷”。
在实际检测中发现，禽流感无论是H9还是H5，与新城疫混合感染时，（在防止针头传播的前提下）做新城疫苗者均有较大损失。建议做二者的灭活苗。
还有一个发现就是，能在有的种鸡场种鸡发病时所用种蛋的孵化死胚中测到H5病毒和新城疫病毒，说明最少在种禽发生新城疫和禽流感时应停用种蛋，新城疫与禽流感能否垂直传播还要待科研人员研究。
（五）、关于野毒与疫苗毒的问题
试纸本身并不能分出野毒和疫苗毒。但我国目前只有注射用的禽流感油乳剂灭活苗，且这些灭活的病毒不会出现在试纸样本采集的气管和肠道部位。所以只要试纸检测到病毒，它就是野毒。
我国的实验室曾研发成功禽流感新城疫基因重组苗。这个病毒是在新城疫病毒上表达一个H5血疑素蛋白，所以在试纸测量中，能测到新城疫病毒，通用型禽流感试纸测不到禽流感病毒，但禽流感H5试纸会检测到H5病毒（实际上是捕获了新城疫病毒上的禽流感H5的血疑素）。不过这一疫苗未在市场上流通。
新城疫油苗也不会被试纸检测到。但在活疫苗免疫后一周内，有可能测到疫苗毒。如果家禽群免疫应答正常时，一周后于测到疫苗毒的概率就大大降低了。但有一点还可以来帮助鉴别疫苗毒和野毒。一般情况下，疫苗毒不会引起家禽群出现大批发病情况。也就是疫苗毒不会出现眼观症状和剖检病变。从做苗时间、试纸测量和眼观剖检情况综合考虑也不难做出正确的判断。
三、试纸本身的检测
试纸的灵敏度可以用标准抗原来测定，其中新城疫试纸还可以用活疫苗来检测。当然，试纸也能测量疫苗有没有病毒、病毒的大致含量。试纸不能直接检测油乳剂灭活苗，经处理去油后的灭活尿囊液是可以测定的。
5. 检测鸡新城疫抗体常用的血清学实验是
血凝抑制试验。